Способ определения чувствительности организма к пыльцевым аллергенам

 

Изобретение относится к медицине, в -частности к аллергологии, Цель изобретения - повышение точности, ускорение и упрощение способа. Изобретение заключается в том, что в суспензию лимфоцитов тимуса крысы вводят последовательно плазму крови исследуемого больного, водный раствор аллергена и водный раствор флуоресцентного красителя 4-{п-диметиламиностирил)- 1-метилпиридиния. Лимфоциты инкубируют с введением ингредиентами, после чего исследуют в люминесцентном микроскопе. Подсчитывают количество флуоресцирующих клеток на каждые 100 клеток в суспензии и при его снижении более чем в 1,5 раза (на 30-70%) по сравнению с контролем/контроль проба без аллергена/ определяют повышенную чувствительность к аллергену. Предлагаемый способ позволяет ускорить определение не менее чем в 5 раз, повысить точность в 1,5 раза, а также упростить процедур , определения. V fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/533

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТО)ИСК()МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4618950/14 (22) 09.12.88 (46) 15.05.91, Бюл. М 18 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) В, В. Косников и Г. Е. Добрецов (53) 615.375(088,8) (56) Косников В. В., Г. Е. Добрецов, 8. А.

Фрадкин, В. А, Скворцова, Оценка степени сенсибилизации больных поллинозами с помощью тест-системы тимоциты крысы-флуоресцентный зонд, Лабораторное дело, 1984, 1Ф 7, с. 423 — 426. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА К ПЫЛЬЦЕВЫМ АЛЛЕРГЕНАМ (57) Изобретение относится к медицине, в

-частности к аллергологии, Цель изобретения — повышение точности, ускорение и упИзобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано в диагностике поллинозов.

Целью изобретения является повышение точности, ускорение и упрощение. способа.

Способ выполняется следующим образом.

В суспензию выделенных обычным способом лимфоцитов тимуса крысы вводят последовательно плазму крови исследуемого больного, водный раствор аллергена и водный раствор красителя 4-(и-диметиламиностирил»1-метилпиридиния (ДСМ) до его конечной концентрации 0.2-0.7 мкМ. Лимфоциты инкубируют с введенными ингредиентами, после чего исследуют в люминесцентном микроскопе, Подсчитывают количество флуоресцирующих лимфоцитов на каждые 100

„„ЯЯ„„1649445 А1 рощение способа. Изобретение заключается в том, что в суспензию лимфоцитов тимуса крысы вводят последовательно плазму крови исследуемого больного, водный раствор аллергена и водный раствор флуоресцентного красителя 4-(и-диметиламиностирил»

1-метилпиридиния. Лимфоциты инкубируют с введением ингредиентами, после чего исследуют в люминесцентном микроскопе, Подсчитывают количество флуоресцирующих клеток на каждые 100 клеток в суспензии и при его снижении более чем в 1,5 раза (на 30 — 70 ) по сравнению с контролем/контроль проба беэ аллергена/ определяют повышенную чувствительность к аллергену, Предлагаемый способ позволяет ускорить определение не менее чем в 5 раз, повысить точность в 1,5 раза, а также упростить процедур, определения. клеток в суспенэии и при его снижении более чем в 1,5 раза (на 30 — 70%) по сравнению р с контролем (контроль — проба беэ аллергена), определяют повышенную чувствительность к данному аллергену.

Пример 1. Обычным способом выделяли лимфоциты тимуса крысы. Для этого GË извлекали тимус крысы, скальпелем делали надрез вдоль органа и препаровальными иглами вытряхивали лимфоциты в раствор

Хенкса. Полученную суспензию клеток разливали в лунки по 0.1 мл в концентрации (10-.-30) млн/мл. В каждую пробу вводили по

2,0 мкл водного раствора ДСМ (10 мкМ— конечная концентрация в пробе 0,2 мкМ) и по 10 мкл плазмы больного M. (аллергический ринит, конъюнктивит) и раствора одного из пыльцевых аллергенов в конечной

1649445

Составитель Р. Гуменюк

Редактор М.Васильева Техред М,Моргентал Корректор А,Осауленко

Эвкаэ 1869 Тираж 417 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москве, Ж-35, Раушская нвб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 концентрации 1000 PNM (мл} водные растворы производства Ставропольского НИИ вакцин и сывороток, PNM 10000. Контрольные пробы — беэ добавки аллергена или сыворотки. Опытные и контрольные пробы помещали в термостат и инкубировали при

37 С в течение 20 мин, после чего по капле окрашенной суспенэии клеток из каждой пробы помещали на предметные стекла, накрывали их пок ров ными стеклами и полученные препараты исследовали в поле зрения л юминесцентного микроскопа(Л юмам И-2, производство ЛОМО, СССР) при возбуждении

405 — 436 нм. Подсчитывали количество флуоресцирующих лимфоцитов на каждые сто клеток.

Параллельно определяли чувствительность к аллергенам с помощью кожных проб. Оценивали чувствительность к следующим пыльцевым аллергенам: лещины, овсяницы, березы, тимофеевки, ежи сборной, лисохвоста.

Воздействие плазмы крови больного M. на лимфоциты не изменяло соотношения флуоресцирующих и не флуоресцирующих клеток, Аллергены из пыльцы злаковых трав и деревьев также не действовали на лимфоциты. Обработка же лимфоцитов смесью плазмы крови с некоторыми аллергенами изменяло долю флуоресцирующих клеток, так, в случае использования специфических для данного больного аллергенов (по результатам скарификационных кожных проб) доля флуоресцирующих клеток резко снизилась. Аллергены же березы и лещины, к которым больной М. не чувствителен (отрицательные результаты кожных проб), практически не влияли на лимфоциты и в присутствии плазмы его крови. Количественной оценкой реакции служит коэффициент К, который показывает во сколько раз снизилась доля флуоресцирующих клеток по сравнению с контролем. В качестве контрольного образца принимали лимфоциты, обработанные только плазмой. Все специфические аллергены (для больного М.) снизили долю флуоресцирующих клеток более, чем в 1,7 раза, но эффект реакции выражен по-разному: коэффициент К составил величину от 1,8 до 5,4. Таким образом, предлагаемый способ позволил выявить аллерген иэ пыльцы лисохвоста, к которому больной М, 5 наиболее чувствителен (К=5,4), Пример 2. Аналогичным образом исследовали плазму крови больного С. (бронхиальная астма, атопическая форма). В каждую пробу (0,1 мл клеточной суспензии)

10 вводили по 7,0 мкл раствора ДСМ (10 мкМ— конечная концентрация в пробе 0,7 мкМ) и по 10 мкл плазмы больного С. и растворов аллергенов. Были оценены пыльцевые аплергены ежи сборной, тимофеевки, лисохвоста, овсяницы, ржи, мятлика, пырея.

Коэффициент К превышал для всех указанных аллергенов величину 1,7. Аллергены из пыльцы тимофеевки вызвал практически полное тушение флуоресценции клеток К= 69, Таким образом предложенный способ позволяет: ускорить поределение чувствительности к аллергену по сравнению с прототипом не менее, чем в 5 раз: повысить точность определения до 100 ; упростить процедуру определения; уменьшить объем необходимой для определения крови с 40 мл до 0,2 мл, Формула изобретения

Способ определения чувствительности организма к пыльцевым аллергенам путем инкубации пассивно сенсибилиэированных лимфоцитов тимуса крысы с аллергеном и

35 флуоресцентным красителем 4(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиний с последующим учетом результатов реакции с помощью люминесцентного микроскопа. о т л и ч а ю40 шийся тем, что, с целью повышения точности, ускорение и упрощение способа, лимфоциты тимуса сенсибилиэируют плазмой крови исследуемого пациента, флуоресцентный краситель используют в концентрации

45 0,2-0,7 мкМ и при снижении количества флуоресцирующих клеток в поле зрения микроскопа в 1,5 и более раз по сравнению с реакционной смесью без аллергена определяют повышенную чувствительность к дан50 ному аллергену.