Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии и может быть использовано для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) Цель изобретения - получение нового штамма клеток, используемого для культивирования вируса лейкоза КРС и позволяющего получить целевой продукт с большей иммунобиологической активностью (видовой антигенной гомогенностью) Штамм клеток почки эмбриона коровы Mi 18 ВСКК(П) 2.99D обладает большей по сравнению с известным перевиваемым штаммом клеток FLK видовой антигенной гомогенностью Культивируется на доступных питательных средах и сыворотках отечественного производства Пригоден для культивирования и накопления вирусной биомассы с целью приготовления иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств, а также при исследовании биологии вируса лейкоза КРС, в том числе для сравнительного анализа антигенных свойств ретровирус в Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

isi)s С 12 N 5/00, 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4713883/13 (22) 05.06.89 (46) 30.05.91. Бюл. М 20 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Д-И.Ю.Адомайтене, А.Й. Немейкайте, Ю.Ю,Рачкус и П,Б.Садаускас (53) 578.085.23(088.8) (56) Stear М.J., Qutteridge P.M., Dufty J.М., Nicholas F.N., Tucker E.М. Antibodies to

ovine lymphocytes exist in bovine

alloantiscra. — Evpi. clin. lmmunogenet, 1986, 3, р.28 — 33.

В.П.Лежа и др. Выделение бычьего вируса лейкоза из продуцирующих культур клеток и изучение стабильности вирионов,—

В, кн.: Репродукция и биологические свойства онкорнавирусов, Рига, 1979, с.60 — 73. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

ПОЧКИ ЭМБРИОНА КОРОВЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии и

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии и может быть использовано для культивирования -вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) и накопления вирусной биомассы для приготовления иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств, а также при исследовании биологии вируса лейкоза КРС, в том числе и для сравнительного анализа антигенных свойств ретровирусов.

Цель изобретения — получение нового штамма клеток, используемого для культивирования вируса лейкоза КРС, позволяю„„5U„„1652338 А1

2 может быть испол ьзовано для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Цель изобретения — получение нового штамма клеток, используемого для культивирования вируса лейкоза KPC и позволяющего получить целевой продукт с большей иммунобиологической активностью (видовой антигенной гомогенностью). Штамм клеток почки эмбриона коровы Mi 18

ВСКК(П) 2,99D обладает большей по сравнению с известным перевиваемым штаммом клеток FLK видовой антигенной гомогенностью. Культивируется на доступных питательных средах и сыворотках отечественного производства. Пригоден для культивирования и накопления вирусной биомассы с целью приготовления иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств, а также при исследовании биологии вируса лейкоза КРС, в том числе .. для сравнительного анализа антигенных свойств ретровирус:)B. щего получить целевой продукт с большей иммунобиологической активностью, т.е. видовой антигенной гомогенностью.

Штамм получают следующим образом.

Почку двухмесячного эмбриона коровы с соблюдением условий асептики помещают на стерильную чашку Петри, измельчают ножницами на кусочки 1-3 мм и проводят щадящую трипсинизацию. Далее клетки ресуспендируют в среде Игла с 10 -ной сывороткой КРС и культивируют в матрасах с концентрацией клеток 5 — 8 х 10 в 1 мл при

37 С. Первый пассаж после формирования

1652338, монослоя в первичной культуре проводят на

7 сут, а последующие — 1 раз в неделю.

Донорами вируса лейкоза KPC при перманентном инфицировании акцепторных клеток первичной культуры служат клетки линии FLK, культивируемые стационарно в виде монослоя с использованием указанной ростовой среды.

Трансмиссию генома вируса лейкоза КРС проводят при культивации первичной культуры клеток почки эмбриона коровы на 3-м пассаже с летал ьно обл учен ны ми (3000 рад) клетками линии FLK.

Полученный штамм, обладающий морфологической и культуральной стабильностью, обозначен Mi 18. Штамм Mi 18 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзный коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 299D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Фибробластоподобные веретенообразные и полигональные клетки, связанные одна с другой отростками, имеют четко выраженные границы, прозрачную цитоплазму. Цитоплаэма и ядро ориентированы по длине оси клеток. В центре клетки имеется крупное ядро овальной формы с 2 — 4 ядрышками. При формировании плотного монослоя встречаются очаги многослойности. В цитоплазме и ядре специфичных включений не наблюдается, Митотический индекс в пределах 17-20 (,.

Физиологические признаки.

Клетки в стационарной культуре растут в виде монослоя в ростовой среде Игла с глютамином или на смеси сред Игла и 199 (1:1) с добавлением 107,-ной инактивированной сыворотки KPC и антибиотиков в обычной дозировке. Оптимальная плотность посева 3 — 5 х 10 клеток в 1 мл. Клетки

4 обладают хорошей адгезивностью. Плотный монослой формируется Аа 5 — 6 сут культивирования. При пересеве культуры, дезинтеграция монослоя производится 3 — 5минутной обработкой клеток подогретой до

37 С с смесью 0,25; -ного раствора трипсина и 0,027ь-ного раствора Версена (1:1). Коэффициент пересева клеток 1:3 — 1:4, пересев производится 1-2 раза в неделю, Кариологическое исследование клеток линии Ml 18, проведенное на 73 пассаже, показало, что размах изменчивости по числу хромосом в клетках в популяции широкий (35-153), ярко выраженная анэуплоидия.

Полиплоидные клетки составляют 82,6, число хромосом в модальном классе 60 — 72, клетки данного класса составляют 35,47.

Эффективность клонирования клеток

Mi 18 в питательной среде Игла с добавлением инактивированной сыворотки эмбриона коровы составляет 85 — 90 .

5 Иммунологический анализ антигенов клеток Mi 18 показал, что в реакции иммунной диффузии (РИД) экстракт клеток реагирует с кроличьей иммунной сывороткой против белков сыворотки. крови KPC. Им10 мунная сыворотка против клеток Mi 18 положительно реагирует в РИД с экстрактом почки эмбриона коровы, а также с белками сыворотки КРС.

При пассировании культуры после 25

15 пассажей при определении ревертазной активности вирусной фракции культуральной жидкости 7-суточной культуры Mi 18 по методу Ложа и др. обнаружена высокая вируспродуцирующая активность, достигающая

20 10 -10 вирусных частиц в 1 мл.

Вирус лейкоза КРС и его антигены, выделенные клетками Mi 18 в культуральную жидкость, выявляются также с помощью

РИД в агаровом геле в варианте для опре25 деления титра антигена, Наличие зкстрацеллюлярного вируса лейкоза KPC u его антигенов в культуральной жидкости клеток Mi 18 регистрируют также при помощи иммуноферментного

30 анализа (ИФА), После осветления культуральной жидкости (5000 об/мин, 30 мин) вирус лейкоза KPC осаждают в 20 -ном градиенте плоскости сахарозы ультрацентрифугированием, лиэируют, иммобилиэи35 руют на полистироловых панелях, инкубируют с антителами против вируса лейкоза КРС и выявляют при помощи вторичных антител меченных пероксидазой.

Интрацеллюлярный вирус лейкоза KPC

40 в клетках Ml 18 выявляют при помощи твердофазного ИФА в варианте CELiSA, когда в качестве тестируемого антигена используют иммобилизированные на дне лунок полистироловых планшет монослойнофик45 сированные и пермаабилизированные клетки.

При обследовании клеток штамма М! 18 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм ) получают отрицательные ре50 зультаты.

При обследовании клеток штамма Mi 18 в опытах на взрослых и новорожденных белых мышах, кроликах патогенных агентов не выявляют.

55 . Криоконсервация.

Для криоконсервации применяют среду

Игла с добавлением глютамина и 107 .-ной сыворотки КРС, В качестве криопротектора используют 10 — ный диметилсульфоксид при концентрации клеток 2-3 х 10 мл. Жиз6

1652338

30

40

55 неспособными после восстановления остаются 80 — 85% клеток, Пример 1. В стерильные 1,5-литровые матрасы заливают по 150 мл суспензии клеток Ml 18 в ростовой среде(3 — 5 х 10 кл/мл), состоящей иэ смеси сред Игла и 199 (1:1) с добавлением 10%-ной сыворотки KPC и антибиотиков в общепринятой дозе. Матрасы герметически закрывают резиновыми пробками и инкубируют при 37 С. Суспенэию вируспродуцирующих клеток для инокуляции готовят при помощи дезинтеграции монослойнорастущей культуры, обрабатывая ее подогретой до 37 С смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора

Версена (1:1). После 2 — 5-минутного воздействия дезинтегратор с монослоя сливают и клетки заливают питательной средой, При потряхивании клетки переходят в суспензионное состояние. Число клеток в суспензии подсчитывают в камере Горяева. Когда рассеянные клетки в матрасах через 6 — 7 сут формируют сплошной монослой и среда приобретает желтоватый оттенок, производят сбор культуральной жидкости с вирусным материалом с монослоя. Монослой вируспродуцирующих клеток деэинтегрируют и рассеивают в новые матрасы, кратность рассева 1:3, 1:4, Собранную культуральную жидкость осветляют при 5000 об/мин в течение 20 мин при 4 С. Затем надосадочную жидкость собирают s обработанные детенгентом диализные мешки. На 50 мл культуральной жидкости берут 10 r 6000 M полиэтиленгликоля (ПЭГ) и при его воздействии собранный материал концентрируют при комнатной температуре 24 ч. Затем концентрат из диализных мешков вынимают, добавляют 0,1 мл 10%-ного тритона Х-100 на 1 мл концентрата и оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Полученный антиген, разведенный физиологическим раствором (1:1. 1:2. 1:4, 1:8, 1:16), тестируют в РИД в агаре, используя положительную сыворотку против вируса лейкоза KPC и отрицательную сыворотку.

Титром антигена считают последнее раэведение, дающее преципитат с положительной сывороткой (1:2; 1;4). ИЗ 1 л культуральной жидкости получают до 1000 доз диагностикума, который можно использовать в качестве тест-антигена в серологических иммунодиагностических реакциях с целью выявления антител к вирусу лейкоза

КРС в сыворотке крови инфицированных животных или других биологических жидкостях.

Пример 2, Вируспродуцирующие клетки Ml 18 культивируют стационарно по примеру 1. Собранную культуральную жидкость с вирусным материалом осветляют при 5000 об/мин в течение 20 мин при 4 С.

Затем вирус осаждают в 20%-ном градиенте плотности сахарозы ультрацентрифугированием при 28000 об/мин в течение 2 ч.

Вирусный осадок ресуспендируют в 5 мл

ТНЭ буфера (0,01 M трис-HCI, 0,1 М NaCI, 0,001 M Маг ЭДТА, рН 7,4) с 15%-ной саха розой. Слой вирусной суспензии наносят на линейный 25 — 60%-ный градиент плотности сахароэы в буфере ТНЭ и ультрацентрифугируют в течение 2,5 ч при 32000 об/мин при

4 С. При помощи микронасоса собирают отдельные фракции, определяют ревертазную активность, диализируют и хранят при—

70 С. Для ИФА используют полистироловые панели отечественного производства с плоскодонными 96-ю лунками, активированные УФ-облучением. Их покрывают вирусным препаратом (100 мкл на лунку) и иммобилиэацию антигена проводят при Ilo мощи инкубации в течение ночи при 4ОC.

Неадсорбированный белок удаляют, промывают эабуференным фосфатным раствором (ЗФР) и проводят блокирование

1%-ным раствором человеческого альбуми-.. на в течение 1 ч при 37 С, после чего лунки опять промывают ЗФР. Далее проводят инкубацию с исследуемыми сыворотками крови KPC (100 мкл на лунку), разведенными

1: IO, 1:50 и 1:100. Контролем служат отрицательные и положительные сыворотки против вируса лейкоза KPC из диагностического набора Курской биофабрики. После . инкубации в течение 1 ч при 37 С лунки промывают ЗФР и вносят вторичные антитела — антисыворотку к иммуноглобулинам

КРС, меченную пероксидазой в рабочем разведении по 100 мкл, и инкубируют при

37 С в течение 1 ч. После промывания ЗФР добавляют субстрат (ОФД- Н20г, и продукты ферментативной реакции определяют спектрофотометрически. Положительная реакция ИФА на наличие антител к вирусу лейкоза КРС у инфицированных животных регистрируется по вычислению относительной величины (0В) оптических плотностей тестируемой и отрицательной контрольной сывороток. При положительной реакции

ИФА OB выше 2.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы BCKK(II) 299D для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота.