Штамм культивируемых клеток papio намаdryаs - продуцент лимфотропного герпесвируса павианов и ретровируса типа с из семейства stlv-1

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

AO ИЗОбРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4696707/1 3 (22) 14. 04. 89 (46) 07 ° 04. 91, Бюл. И 13 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии АМН СССР и Институт цитологии АН СССР (72) В.З.Агрба, Л.А.Яковлева, В.В. Тимановская, В.В. Какубава

С.Е.Мамаева, Д. Э.Аравиашвили, Л,В.Инджия, М.Т.Иванов .и Б.А.Лапин. (53) 578. 085 ° 23 (088, 8) (56) Шевцова 3.В. и др. Итоги изучения лимфоидной ГВП-продуцирующей линии клеток 594$, полученной от павиана гамадрила со злокачественной лнмфомой. — B кн. "Злокачественные лнмфомы и ассоциированные с ними лимфотронные вирусы. /Под ред. Б.А.Лапина и Л.А.Яковлевой. — M 1986, с.141-143; (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КПЕТОК PAPI0 HANMRYAS — ПРОДУЦЕНТ ЛИМФОТРОПНОГО ГЕРПЕСВИРУСА ПАВИАНОВ И РЕТРОВИ. РУСА ТИПА С ИЗ СЕМЕЙСТВА STLV-1, (57) Изобретение относится к экспеИзобретение относится к экспериментальной онкологии и может быть использовано в онковирусоло гических исследованиях при получении на животных модели вирусиндуцированной злокачественной лимфомы.

Целью изобретения является получение стабильной клеточной линии, продуцирующей ГВП и ретровирус типа

-STLV-1 .

Штамм получен путем трансформации

in vitro лимфоцитов периферической.„Я0„„164О159 А 1

2 риментальной онкологии и может быть использовано в онковирусологических исследованиях для получения на животных вирусиндуцированных злокачественных лимфом. Целью изобретения является получение стабильной клеточной линии, продуцирующей ГВП и ретровирус типа -STLV-1. Штамм ВСКК (II)-292D получен при трансформации, лимфоцитов периферической крови клинически здоровых павианов гамадрилов вирусом ГВП (герпесвирусом). Штамм продуцирует онкогенные вирусы — лнмфотропный герпесвирус павиана и ретровирус типа С; обладает трансформирующей активностью для лнмфоцитов приматов in vitro и онкогенной активностью для кроликов in vivo. Клетки способны культивироваться на пита/тельной среде, в которой эмбриональ. ная сыворотка коров полностью заменена на бычью сыворотку отечественного производства, сохраняя при этом биологическую активность (способность вызывать опухоли). 1 табл. крови клинически здоровых павианов гамадрилов вирусом ГВП, выделенным в лимфоидной линии клеток КМПГ-1, полученной из костного мозга больного злокачественной лимфомой павиана га- . мадрила. Лимфобластоидная трансформа.ция клеток произошла на 21-й день культивирования инфицированных лнмфоцитов. Последние культивировали в пробирках на среде РРМ1 1640 с 15Х-ной эмбриональной сывороткой коров в при сутствии 300 мкг/мл 1-глютамина и антибиотиков: 100 Ед./мл пенициллина и 1 00 мкг/мл стрептомицина. Через

21 день культивирования среда куль- тивирования стала активно метаболизироваться без признаков прикрепления .к твердому субстрату.

Таким образом, сформированная суспензнонная культура клеток ВПЛ-II стабильно сохраняет свои ростовые потенции и биологическую характеристику.

Штамм хранится в Специализированной коллекции соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции кле- 15 точных культур под номером BCIGC(XT)2929.

Морфологическая характеристика и культуральные свойства.

Пос гоянная клеточная культура

ВПЛ-II является суспензионной, клетки которой пролиферируют в жидкой среде без признаков прикрепления к твердому субстрату. Культура представлена лимфоидными клетками, но морфологиче ской характеристике напоминающими лимфобласты. Основная масса клеток— это крупные клетки с большим выраженным ядром и узким ободком цитоплазмы. Крупное ядро имеет нуклеогла, одну крупную иди две поменьше, окр " шивающиеся в нежно-голубой цвет при окраске препарата по Романовскому имза. Наряду с крупными клетками ь стре чались и кле тки меньших разме ров., содержащие ядро с нуклеонами.

В культуре встречались и макрофаги, составляющие 1-2% всей клеточной популяции.

Время удвоения клеточной массы 40 линии BIIJI-II сосгавляет 48 ч. Посевная доза 4 — 5x10 кл./мл. На 5-6-й день культивирования культура дости,гае r максимальной клеточной плотности„составЙяпощей 7,5-8,0 х 10 кл./мл.

Ф

Клетки культуры можно адаптировать к условиям культивирования в менее обогащенной среде. Так, первичная культура культивировалась на среде с 15% эмбриональной сыворотки коров, затем

50 стабильную линию удалось адаптиро вать к условиям содержания в пита" тельной среде с 8% эмбриональной сывыротки. Затем культура была адаптирована к среде, в которой 8% эмбриональной сыворотки были заменены на

55 i 5% сыворотки крупного рогатого скота отечественного производства. При этом число мертвых клеток на среде с эмбриональной сывороткой составляло

8-10%, а на среде с отечественной бычьей сывороткой было лишь немногим ,больше, т.е. 15-20%.

Клетки культуры хорошо переносят криоконсервацию. В качестве криопргтектора используется питательная смесь с 8%,-диметилсульфоксида.

Цитогенетическая характеристика, Цитогенетический анализ 50 метафаз линии ВПЛ-ГХ выявил наличие кариотипически различных два клона: 30— с нормальным кариотипом - 42,ХХ;

20 — с патологическим — 42,XX--17, 20, М, М.

Иммунологнческая характеристика клеток. Клетки штамма ВПЛ-ГХ не образуют К-розетки с эритроцитами барана, экспрессируют поверхностные и питоплазматические иммуноглобулины

ИЯ. Небольшой процент клеток содержит рецепторы к комплементу. Моноклональный В-клеточный фенотип клеток штамма ВПЛ-ХХ подтвержден в исследованиях с моноклональными антителами (Мон АТ). Результаты исследований представлены в таблице.

В отли ие от ÂIIII-TT клетки известного штамма 59чЯ"Pg не экспрессируют поверхностные и цитоплазматическне иьачунсглобулины, не имеют рецепторов к комплементу. Клетки известного штамма реагируют с Мон AT GKT, выявляющими Т"клетки с рецепторами к эритроцитам барана и грактически не содержат общего В-клеточного антигена (1P:<).

Зле ктронно-микро ско пическая характеристика. На ультратонких срезах клеток штамма ВИЛ-XT. при анализе в электронном микроскопе SKI 100m нри инструментальном увеличении от

5000 до 50000 были обнаружены вирусные част щы, имеющие морфологическую характеристику ретровирусов типа С. Вирусная популяция характеризовалась выраженным полиморфизмом.

Размеры .частиц колебались в пределах от 60-70 до 250-400 нм. Размеры нуклео гида, имеющего округлую форму, полигональную или конусовйдную форму, составляли от 30 до 250 нм. Вирусные частицы локализовались в цистернах цитоплазмы или внеклетсчно.

Наблюдались маccHBHbIB скопления ви

l русных частиц. Вирус, обнаружнваемьж в клетках штамма BIIII-ХХ, имел структурное сходство с вирусами группы

5 16 ?01

НТ1Л-1. В О,SX клеток штамма Об!«ару.)KHB алксь также в иру сные час ткцы с морфоло гиче ской структурой вируса герпеса. Вирусная популяция, состояшая из незрель«х и зрелых вирусных част!«ц, располагалась в ядре . цитоплазме, а зрелъ«е частицы — в межклеточном пространстве.

Трансформирующая активность. Трапс-10 формирующая активность была изучена на лкмфоцитах павианов гамадрклов (возраст животных 6-8 мес) и лимфоцитах крови пупочного канатика человека. Культуральная жидкость штамма

И«Л-II, взятая на 7-й день !<у.«üòèBHрования без смены среды при 37 "С, фильтрованная для освобожден,-я от .,)«еток и их обломков через мембранные фильтры с размером пор 0„45 мкм, в 20 титре 10 ТД(50) 0,5 мл, вызывала л. .:lфобластоидную трансформацию лкмфоцитов периферической крови I«aBHa!«<)B через 20-25 дней после кнфкпк, >ва!«««я.

Что касается лимфоцитов крови пугоч-- 25 ного канатика человека, то трансформирующая активность виру "îâ для указанных KJ«eTol< выявлена не была в чение более месяца ««абл«одения -.

Онкогенные caoHcтва. Онкоге.-. Ост.: 30 вируса (ОВ), реплициру) -гхся B .:уль. туре ВПЛ-ГХ, изучала. ь ча бе=породив«х кроликах а К?ультуральная жидкО сть на 6-7-й рень культивирования без смены питательной среды бьи?а фи««ьтроg J? вана через мембранные фильтры с раамером пор 0,45 мкм для освобождения от клеток и их обломков. БесклеточН»II"«материал B объема 10 мл был введен 2-3-месячным кроликам внутримышечно. Через 20-25 дней на месте введения пальпировалось округлое образование, имеющее тенденцк«о к росту.

Через 35-36 дней у кроликов, забитых эфиром в предагональном состояBHH,aë— ределялась следующая картина: опухольь размербм 2х3 см на л«есте введения, метастазы в легкие, ткмус, значительное увеличение паратрахеальных лю«фотических узлов и умеренное паховых, увеличение селезенки, достигающей 5 г (в номере у кроликов этого возраста вес селезенки составлял

1,0 г). В бр«ошной ределялся геморрагический асцит. з5

Гкстологически: на гистологкчсских срезах, окрашенных гематоксилиэозкном, взятых из первичной опухоли, а также легких, почки, селезенки и паратра;-.еальны.: лимфа ск —,ес;<««х узлов Обнаружены структуры злока:,:ест«?енной лкмфомы с явлением генералкзацкк с вовлечением в про«:.есс r«c< õ перечисленных органов.

Молекулярно-б «О;..О;- ческая и бкохкмк еская хара«<теристкка.

Определение и характеристика ГВП и ЯТ "??-1 ««Оследова)ел-.костей в клечках ВПЛ-1 проводилось :. помощью метода молекулярно"I lкбрн?диз:- «кк по

Саузерку с ксгокьзов »! ем ферментов

Ре ствикци«; Fat Ii ;.. coR1 . -> Кле тках указ анно 0 ш та! ?? ? бь«л О бнаружен инте гр!«!)О!ва: .:«ый про.:иоус. p.=.-:- ы Hryca типа ", сбезья . «!.?«е!ощ«:;:. "Не .Оторые отлкчкя по сж :.—,ам рестрикции От ретроBHpyса типа С человека ЯТ«. 7-1. РестРкктквкые;<ар":! ГБП, Репродуцкрующе гося в клетках ВПЛ-. I, аналогичны вирусу ш .амма 5948-1 gä.

В у?льтрацен .-в«;ф,?-.атс культу?Ральнои жидкости шт;-.има ВПЛ-ХХ обн.=.ружена реве ртаз а, ак тпвно транср «-биручощая синеткческую иa";pHI?; пол!«(РА)олиго !.ДТ) «о в пр««сУтств««к конов МЯ > l что характе o,"„äÿ обратной транскри? «тазь! Он«<ов кру сов груп«т?! HД Ъ 1 а

Щта ;ъ! в!«-,yc,.-!!)Одуциру«ощей «;-леточ ной линк! ВГ?!" ХТ caхраняет неиэ?менны ии свои бкологическ!«е характеристики на протяжен.:и, 17 пассажей непрерыв:-!о го <у!«Ьтивиров :!«!" =, "-. также рекультив кров анин i,*a еле а о a ÍIB анин на про тяже «ик ле

П р H и е р 1. Клетки шт. Има !.

БПЛ-II в колкчс.стве 4!К10 - кл. /мл лктательной сие си, со сто. :ш!ей кз 92К среды PPNI1640 в сочетании с ЗЖ эмбриональной <.ывороткк .-.",.>pcB, 300 мкг,/««л 1 — глютамкна и антибиотиков:100 Бд.? мл пенкци?:л=. a H

I ОО мк г/мл стра птом«!?ц««на > помещали во флаконы емкостью 300 мл в количестве 50 ил. Культ?-!в!«Ревел!«6 дней о без смены среды в термостате при 37 С.

-Ia 7 и день куль! «?? крован««Я клетки отделяли центркфугкрован!«ем (1000 об!ми!«за 10 икн прк 4 С), а надосадок, представляющ!«й вкруссодержащу?о кул -.typaëBíyþ жидкость, фильтровалк через мембранные филь

?!-? !! ры фирмы ««клл!«пор с размером пор

0,45 ики для удаления клеток к клеточУ ных обломков. Фкльтрова?льная культуральная жидкость представляла вирусный материал, который =âîäèëè беспородным кролика. в возрасте 2Штамм культивируемых клеток Papio

hamadryas BCKK(TX)-2929 — продуцент лимо Рропного" герпесвируса павианов и ретровируса типа С из семейства

STLV-1.

Мон AT

Поверхностные иммуноглобулины

Внутрнщитоллаэ матичесние иммуноглобулины

Роэетки

KT 11 Рз(СД о) с се ТАЧ ИКО-1 ОК Ха-1 и-РОК В (4 С) ЛВт

РОК

КЛС

РОК

9 2 3 61 3 70

41,8 . 9,7 f,8 2,0

О о

\Ю

Составитель И.Тареева

Техред Д. Олийнык,, Редактор И. Де р бак Корректор А.Осауленко ч .е ФФ1ЮЭЮВЮЮм

Заказ 997 Тираж 383 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 яаее юеаам ° и ч

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

7 1б

3 месяца в количестве 10 мл внутримышечно Через 20-25 дней на месте введения материала обнаруживали не.большое подвижное образование с четкими контурамиР плотное, размером

1 х2 см в среднем, а также небольшое увеличение периферических лимфатических узлов. Через 35-36 дней у кроликов наблюдалась генерализованная лимфома: опухоль на месте введения размером 2х3 см и больше, значительное увеличение селезенки, метастазы в легкие, тимус, лимфатические узлы, подкожные кровоизлияния.

Пример 2. Клетки штамма BIIJITI в количестве 4х10 о кл/мл в питательной смеси, аналогичной примеру 1, за исключением сыворотки (дорогостоящую импортную 8Х-ную бычью змбриональ21ую сыворотку заменили на 153-ную легкодоступную бычью сыворотку отечественного производства), засевали и культивировали по примеру 1. Культуральную жидкость собирали обрабатывали и вводили кроликам аналогично примеру 1. Через 45 дней наблюдения у кроликов отмечались опухоли на месте введения, увеличение лимфатических узлов и с леномегалия.

Индуцированцые окко генными вирусами павианов (ГВП и ретровирусом типа С) опухоли кроликов являются доказательством онкогенной активности ассоциации двух типов лнмфотропных онковирусов приматов и служат лабораторной моделью вирусиндуцирован ных злокачественных лимфом-человека, поскольку онковирусы, реплицирующиеся в предлагаемом штамме, являются аналогами онковирусов человека:

ГВП аналог вируса Эпштейн-Барр, а ретровирус- типа С павианов STLU-1

10 аналог HTLV" 1.

Таким образом, с помощью предлагаемого штамма можно закономерно воспроизводить вирусиндуцированный опухолевый процесс у кроликов, аналогичный таковому у человека, на котором возможно изучать этнологию, патогенез, вакционопрофилактику и противоопухолевую активность различных химиопре паратов. Полученная мо20 дель служит также объектом для изучения и разработки методов ранней диагностики опухолевых заболеваний.

Кроме того, культивирование штамма возможно с применением бычьей сыво25 ротки отечественного производства с сохранением биологической активности его, что значительно удешевляет его использование, 30 Формула из о бре тения