Штамм культивируемых межвидовых гибридных клеток мыши mus мusсulus l. и норки мusтеlа vison - продуцент легких цепей моноклонального иммуноглобулина норки

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для получения моноклональных L-цепей иммуноглобулина американской норки. Цель изобретения - получение штамма культивируемых межвидовых гибридных клеток мышь х норка, продуцирующих моноклональные L-цепи Ig норки. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы NSO с лимфоцитами норки. Ытамм культивируют в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы со стандартными добавками . Клетки пересевают через 3-4 дня с начальной концентрацией 6-105 - 106/мл. Клетки штамма продуцируют стабильно в течение 40 пассажей 3-4 мкг/мл L-цепей. При хранении культуральной среды при 4°С содержание L-цепей не снижается. L-цепи идентифицируют с помощью специфических антисывороток иммуноферментным методом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 230D. ел

СОЮЗ СОНЕТСНИК

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИИ

„.SU„„1641885 A 1 (51)5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к втоЕСН0ММ СвидктаЛьСтач

Для слияния используют двухсуточную, (б культуру клеток NSO и В-лимфоциты р . норки на третий день после антигенного стимулирования.

Клетки NSO культивируют на среде

ДМЕМ или RPMI-1640 с 107 эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 8-азогуанином.

Слияние (гибридизацию) с В-лимфоцитами норки проводят в стандартной среде без сыворотки, с добавлением

1 полиэтиленгликоля (M. В, 1500) при соотношении клеток 1: 10 соответственно.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4621414/13 (22) 15.12.88 (46) 15.04.91. Бюл. Ф 14 (71) Институт цитологии и генетики

СО АН СССР (72) Н.Л.Галахарь, С.Н.Дьяченко, Е.Г.Уфимцева и О.К.Баранов (53) 578 .085.23 (088 ° 8) (56) Галахарь И.А., Дьяченко С.Н., Фомичева ИЛ. и др. Материалы Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток в культуре. М., 1986, с.97-98. (54) ПП АММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЕЖВИДОВЫХ

ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК MblDJH MUS MUSCULUS L.

И НОРКИ MUSTELA VISON — ПРОДУЦЕНТ

ЛЕГКИХ ЦЕПЕИ МОНОКЛОНАЛЬНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НОРКИ (57) Изобретение бтносится к гибридомной технологии и может быть использовано для получения моноклональЙэобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для получения моноклональных

L-цепей иммуноглобулина американской норки.

Цель изобретения — получение штам,ма культивируемых межвидовых гибридных клеток "мышь у норка", продуцирующих моноклональные L-цепи Ig норки.

Штамм НМ-7, ВСКК(П) У 230 Д получают следующим образом.

Клетки мьппиной миеломы NSO гибри",дизуют с иммунными В-лимфоцитами американской норки (Mustela vison).

2 ных Е-цепей иммуноглобулина американской норки. Цель изобретения — получение штамма культивируемых межвидовых гибридных клеток "мышь х норка", продуцирующих моноклональные L-цепи

Ig норки. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы NSO c лимфоцитами норки. Штамм культивируют в среде RPMI-1640 с 10Õ сыворотки эмбриона коровы со стандартными добавками. Клетки пересевают через

3-4 дня с начальной концентрацией б ° 10 — 106/мл. Клетки штамма продуцируют стабильно в течение 40 пассажей.

3-4 мкг/мл L-цепей. При хранении культуральной среды при 4 С содержание L-цепей не снижается. L-цепи идентифицируют с помощью специфических антисывороток иммуноферментным методом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 230D.

1641885

После обработки в течение 3 мин полиэтиленгликолем клетки осаждают центрифугированнем при 800 об/мин и суспендируют в среде RPMI-1640 с

5 добавлением 15Х эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 MM глютамнна, 1. мМ пирувата натрия, 4 10 4аминоптерина, 10 4гипоксантина, 16 ° 10 М тимидина и антибиотиков, 10 (НАТ- среда). Суспензию клеток (10 кл/мп) разливают по 0,1 мп в лунки 96-луночных пластиковых планшетов и культивируют при +37 С в атмосфере 6Х СО ° Первую смену среды производят через 5 сут после гибридизации, в дальнейшем — через 2-3 дня.

Через 2 недели после гибридизации

НАТ-среду заменяют на HT-среду (сре, ду без аминоптерина), а еще ч ерез

1 неделю на обычную ростовую среду (беэ гипоксантина и тимидина) .

Рост гибридных клеток контролируют при микроскопировании панелей.

Из лунок, в которых площадь растущих колоний гибридных клеток достигает 1/3 и более площади лунки, исследуют культуральную среду на присут ствие Ig H KH H H его цепей. Детекцию Ig норки и его цепей проводят при помощи иммуноферментного анализа с использованием антисывороток к Ig норки, его легким и тяжелым цепям.

В качестве субстрата использован диаминобензидин. Каждый иммуноферментный анализ (EDSA) сопровождается калибровкой Ig норки и контролемкалибровкой мышиного Ig и интактной культуральной среды. При первичном отборе выбирали колонии с более высокой продукцией L-цепей Ig.

При Ъостоянном контроле уровня и специфичности синтеза Ь-цепей норки проводили клонирование методом лимитирующих разведений, отобранных пер4

45 вичных гибридом. При клонировании использовали слой клеток-кормилок (фидер) из спленоцитов мышей линии

BALB/ñ пи/пи.

Процент позитивных клонов при 5и 6-м клонировании достигает 89-90, Из них отбирают наиболее активный продуцент L-цепей Ig норки и обозначают как штамм НМ-7.

Штамм обладает следующими призна хами.

Морфология клеточной культуры.

Культура- представляет собой округлые, слабо прикрепляющиеся к субстрату клетки. Ядра занимают большую часть клетки, Цитоплазма в виде тонкого ободка .

Кариология штамма, Модальный класс хромосом 94-101. Хромосомы представлены в основном телоцентрическими, но 5 пар — субметацентрическими (норочьнми) .

Культуральные свойства.

Клетки штамма пересевают на среде

RPMI-1640 с 10Х эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата, 2 MM глютамина и антибиотиками в стандартных дозировках при

36,8-37 С.

Характер роста клеток: стационарная суспензия. Частота пересевов: через 3-4 сут. Посевная доза клеток

1 10 -10 кл/мл. Кратность рассе5 б ва: 1:2, 1 3 °

Консервация клеток: клетки заморожены в жидком азоте на 25,30 пассажах по 13 ампул каждого пассажа и 5.10

6 клеток в ампуле.

Криозащитная среда: ростовая среда с 50Х сыворотки крупного рогатого скота и 10Х глицерина. Выживаемость клеток при замораживании 50-70Х .

Сведения о контаминации клеток штамма.

Бактерии, грибы, дрожжи, мнкоплазмы не обнаружены.

Физиолого-биохимическая характеристика.

Клетки растут при 36,8-37 С и опо тимуме рН от 6,0 до 7 1. При культивировании клетки штамма секретируют в культуральную среду легкие (1.) цепи Ig норки, что установлено с помощью иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозе с антисыворотками к IgG. норки, к легким и тяжелымцепям Ig норки.

Уровень продукции L-цепей Ig норки соответствует 3000-4000 нг/мл (или 3-4 мкг). При хранении в течение не менее 14 дней при 4 С количео ство L-цепей Ig в культуральной жид" кости не снижается.

Использование штамма иллюстрируется на примере наработки моноклональных L-цепей в течение 40 пассажей без реклонирования гибридомы с изучением уровня продукции L-цепей и о сохранности их при хранении при 4 С.

Результаты опьггов показывают, что уровень продукции L-цепей в течение 40 пассажей остается стабильным и составляет 3-4 мкг/мл.

Составитель Г.Игнатьева

Те хр ед М, Дидык Корректор М.Демчик

Р еда к тор Т. Ла з ор енко

Заказ 1126 Тираж 377 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 1641885

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я и норки Iustela vison ВСКК(П) Р 230Д—

Итамм культивируемых межвидовых продуцент легких цепей моноклональгибридных клеток мыши Mus musculus L. ного иммуноглобулина норки.