Штамм культивируемых гибридных клеток животных мusмusсulus l - продуцент моноклональных антител против фактора н @ эритроцитов крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для идентификации антигена группы крови Н на эритроцитах быка Цель изобретения - получение штамма культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против антигена II1 эритроцитов быка. Штамм получают гибридизацией клеток пиеломы Sp2/0 (сублииин SpEBR-5) с клетками селезенки мыиеи Balb/c, иммуни-jHpoванных эритроцитам быка Штамм культивируют в среде ДНЕМ с 10% сыворот си эмбриона коровы и стандартными добавка П1 Клетки пересевают 1:3 каждые 48 ч с начальной концентрацией 1,. Утамм прививается с.ннгенным мьпдап в виде асцитной опухо Ш, Ытамм продуцирует монАТ класса IgGk Взаимодействие монАТ с 3pnTpou«Tahm оценивают в реакции комплементзависимого гемолиза. Титр монАТ в асцитной жидкости в данной реакции 10 „ Итамм депонирован под номером ВСКК(П) № 264D,s Ј (/

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕаЪЬ ЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4621996/13 (22) 19.12,,88 (46) 30.04.91. Бюл. К 16 (71) Институт цитоггог»п» АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики животных ВАСХ161Л (72) Т.Н „Игнатова, Е. Р. Березкина, З,В. Ковалева, В.П. Павличенко, О.В. Иилованов, А.П. Супрун, Т.11,Гринчук, IJ.Т„ Паньшина, Е.Э. Завадская, А.Г„ Па»»ьыин и И,В, Волкова (53) 578.085.23(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1531487, кл, С 12 Il 5/00, 1988, (54) ШТА1 1И КУЛЬТИВИРУЕИ1 1Х П1БРИДН1!Х

КЛЕТОК )iGIBOTHIIX МАК ifUSCULUS L-ПРО 1УЦЕНТ ИОНОКЛОНАЛЬННХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ

ФАКТОРА Н ЭРИТРОЦ) IТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к гибридонной технологии и может быть ис °

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использо. вано для идентификации антигена группы ».ров»» 11 на эритроцитах быка„

Цель изобретения — получение штамма куг»ьтивг»руег»ьх клеток, продуцирую Ii(2»онок лог»альные аг»титела (мОHA ) против антигена Н эритроцитов бьн;а.

»

11тами получают следующим образом.

Клетки мышиной 2»I»enon»b» Sp 2/О, устойчивой к Sx10 мг/мл броиистого этидия (Sp EBR-5), гибридируют с помоцью ПЭГ 1000 с клетками селезенки мь»ши линии Ва1Ь/с, иг»2»унизированной

„„SU„„1645296 А 1 (gI) g С 12 ll 5/00, С 12 Г 21/08 пользовано дггя иден г»»»»гика»»гп» антигена группы крови Н 2»а эритроцитах бь»ка, Цель изобретения — получение ытамма кys»bn»III»pyer»bл»х клеток, продуцирующих

2»оггоклоиальггые антитела (монАТ) против антигена Н эрпгроцитов быка„

Ыта2»ь»»»олучаыт гибри,в»зацией клеток г»исломы Sp2/О (субд»»г»г»г» 81ЕВБ.— 5) с клетками селезенки 2»ba»eI! Ва1Ь/с, иммунизированных эрг»троцг»таге» быка.

11та2»м культивируют в среде Д1ЕИ с 107 сыворотг»н эмбриона коровы и стандартныг»и добавка2»2». Клетки пересенают 1:3 кажлые 48 ч с начальной концентрацией

1,5 10 /мл. Нта2»м прививается сингенным 2»ыггаг» в виде асцитной опухо.»г», 11тамм нродуцируе r монАТ класса IgG, Взаимодействие монАТ с эритроцитами оцег»г»ва2зт в реакции комплементзависимого гемолиза Титр монАТ в асцитной ха»дкости в данг»ог» реакции 10 . штамм

5 депонирован под номером ВСКК(П) Р 2640 эритроцитагги быка, несуц»»2»и антиген» ньп» фактор Н наряду с другими. Схема иг»2»угп»зации: 10 эритроцитов/мышь внутрибрю»ггинг»о (в/б) — ин гервал

21 день — 5x1 0 эритроцитов/мыпь

5 в/б — через 4 дня 2»ыпь забивают.

В результате тестирования полученнь»х гибридных культур по признаку продукции антител против антиге на Н и последующего их клонирования отбирают птаге», продуцируюций монАТ против антигенного фактора Н

Клетгл» данного итаг»2»а прививают мышам линии Ва1Ь/с и получают асцит, 1645296 используемый в качестве реагента для типирования эритроцитов по ан1 тигену 11

Полученный штамм хранится в Специализированной коллекцИи клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером BCKK(II) 12640.

Культуральные свойства.

Ита«»«» культивируют на ростовой 10 среде Игла в моди в»кации Дальбекко (ДАБИ) с добавлением 10Х сыворотки эмбриона коровы, а также 1 мИ замени««ых аии««окислот, 1 ьИ пирувата натрия, 2 «Ж глутамина, 5х10 мИ 2-мер- 15 каптоэтанола и 40 ед./мл гентамицина. о

Культивирование проводят при 37 С в инкубаторе с содержанием 5-8Х СО или в герметических флаконах в тер- 20 мостате без подачи СО . Способ культивирования суспензионный. Кратность рассева 1:3 при пересеве через 48 ч. .Посевная доза клеток 150 тыс. клеток/мл

У а макси«»альная плотность популяции 25

600 тыс.клеток/мл. При росте на указанной среде клетки штамма имеют округлув форму. Время удвоения популяции 36 ч. Клонирование клеток проводят в 96 ячеечных платах предельным 30 разведение«» с использованием в качестве фидерного слоя макрофагов мьппей.

При посеве 3-4 клеток в лунку эффективность клонирования 70 .

Криоконсервацию проводят в сыво35

porke эмбрионов коров с добавлением

10 диметилсульфоксида (ДИЯО) при концентрации 1х10 клеток/мп. Жизне6 способность клеток при размораживании

75-80Х.

Прививка клеток штамма «« 264 сингенным «»ьппа«» вызывает у них образование асцитной опухоли, сопровождаюце««ся выделением асцитной жидкости в 45 количестве от 1 до 8 мп. В асцитной ж«»дкост«» содержатся специфические монАТ к H — антигенному фактору крови быка. Способность в продукции монАТ клеткам птамма Р 264 сохраняется на протяжении трех месяцев непрерывного культиш»рования клеток. После раз«»оралива«»ия клеток способность продуцировать мопАТ сохраняется. Прививка мьыам штамма на разных пассажах культивирования стабильно вызывает обраэова««ие асцитных опухолей у мышей с высоким титром монАТ в асцитной ю»дкости.

/ «я кариологического анализа клеток штамма D 264 используют 100 метафазных пластинок хромосом, Иодальный класс не выражен, разброс хромосом от

47 до 113; 22Х от обцего числа проаналиэированн««х клеток (и = 100) имеют количество хромосом от 96 до 100. В

50 клеток встречаются центромер-положительные минихромосомы в количестве

1-3 на геном„

Характеристика монАТ, продуцируемых штаммом D 264„

Специфичность полученных ИЕА определяют с помощьв стандартного серологического теста гемолиза. Анализ проводят на панели эритроцитов, состоящей из 120 образцов крови КРС, у которых заранее определяют антигенную структуру по группам крови с помощью

«»оноспеци ических аллоантисывороток.

Полученные ионАТ проявляют специфичность, аналогичнув моноспецифической сыворотке анти-Н

ИонАТ принадле>кит к классу IgG ««o да««««ь»«» молекулярных весов цепей. определяемых методом электрофореза.

Продуктивность клеток штамма D 264.

При культивировании клеток штамма

D 264 в м«п:«ах линии Balb/с от одной мыл«и получают от 1 до 8 мл асцитной жидкости (в среднем 4 мл). Титр антител в асцитной жидкости, установленньп« с помоцьв гемолиза эритроцитов

КРС микрометодом, составляет 10

Использованием штамма поясняется примером идентификации с помощью монАТ D 264 антигена Н» на эритроцитах коров методом реакции гемолиза.

П р и и е р. Исследуют эритроциты от 120 животных. В качестве сравнения для типирования эритроцитов применяют специфическув аллоантисыворотку ь против антигена Н. Готовят индивидуаль««ь«е суспенэии эритроцитов КРС, кровь из яремной вены крупного рогатого скота отбирают в пробирки со .стандартным антикоагулируюцим раство» ром, эритроциты 4 раза отмывают

0,08 .-«««««» раствором хлористого натрия путем последовательного центрифугирования и разбавления (10 «»ин, 2000 об/мин), приготовляют 2,5Х-ную суспензню эритроцитов в 0,08Х-ном растворе хлористого натрия. Затем в

96-ти ячеечных планшетах для иммунологических реакций (пр-ва СССР) смешивают 20 мкл асцитной жидкости в

20 мкл суспензии эритроцитов. Получен5296 штамм культивируемых гибридных клеток животных MUS MUSCULUS L °

BC1iK(II) М 264 D — продуцент моноклональных антител против фактора

20 Н эритроцитов крупного рогатого скота.

Составитель Г. Игнатьева

Техред М.Дндык Корректор М. Шароши

Редактор С. Лисина

Заказ 1322 Тираж 387 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

164 ную смесь ннкубнруют при 37 С в течение 30 мин н добавляют 50 икл кролнчьего комплемента, затем снова инкубируют в течение одного часа при 37 С о и оценивают гемолиз по четырех балльной системе. Анализ показал, что монАТ D264 вызывают гемолиз только тех эритроцитов, которые наряду с

1 другими, несут антигенный фактор Н и не реагируют с эритроцитами, не содержацими антигенный фактор Н 1.

Для установления титра монАТ асцитную жидкость разводят 0,087.-ным раствором хлористого натрия и определяют максимальное разведение, при котором она еце способна вызывать гемолиз эритроцитов КРС. С этой целью использовали укаэанный метод постановки реакции гемолиза. Установлено, что полученные монАТ вызывают гемолиз эритроцитов, несуцнх антигенный фактор: Н, вплоть до разведения 1:10

Таким образом, в результате ис» пользования предлагаемого изобретения получен реагент, позволяккций типировать коров с Н1-антигенньм фактором в S-системе групп крови. Pea1ð гент по активности (титру антител

10 ) в 30 тыс. раэ превмзает стандартный препарат (титр 1:32). формула изобретения