Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к днк- зависимой рнк-полимеразе бактериофага т7.
Изобретение относится к гибридомной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией силеноцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы, бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии X 63. АГ 8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (0,05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед./мл). Частота пассирования 2-3 раза в неделю , посевнаядоза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5-10 раз. Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 10 в асцитической жидкости. Мон AT, секретируемые штаммом, специфически взаимодействуют с РНК-полимеразой бактериофага Т7. Штамм депонирован под номером BCKK(II)-3S2 D. Мон AT относятся к классу Jg G1. W
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
РЕСГ1УБЛИН (51)5 С 12 N 5/00 С 12 Р 21 08
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМ",Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ
2 моноклональные антитела (Мон AT) к
PHK-полимеразе бактериофага Т7.
Штамм получают гибридизацией силеноцитов мышей линии BALB/Ñ, иммунизированных очищенным препаратом РНКполимеразы, бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии Х 63.
АГ 8,653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (1 07), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (О, 05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед. /мл) .
Частота пассирования 2-3 раза в неделю, посевная- доза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5-10 раз °
Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 10 в асцитиче ской жидкости. Мон AT, секретируемые штаммом, специфически взаимодействуют с РНК-полимеразой бактериофага Т7. Штамм депонирован под номером BCKK(II)-352 D. Мои.AT отно- сятся к классу Jg С1. лап по 35 мкг антигена с полым адьювантом Фрейнда. Через 4 недели мышей иммунизируют подкожно в несколь1 ко мест вдоль спины, шеи и тулов ища
50 мкг антигена в неполном адьюванте
Фрейнда. Через 4 недели вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинйо без адьюванта. Через 10 дней неиммунные мыши линии BALB/С летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, которым через 24 ч после облучения внутривенно вводят лимфоциты, полуГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21 ) 4685571/1 3 (22) 25. 04. 89 (46) 07. 04. 91. Бюл. У 13 (71) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта (72) И.Л.Дегтярев, Д. А. Костюк и С.Н.Кочетков (53) 578.085.23(088. 8) (56) Car rol S. В., Stol 1 a r В, D. В roc.
Nat. Acad. Sci. USA. — 1982, v. 79, р. 7233-7337. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЪТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MJS MUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЕ БАКТЕРИОФАГА Т7 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической PHK-полимеразы.
Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующе го
Изо бре тение о тно сит ся к гибридной биотехнологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариоти ческой PHK-полимеразы.
Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мон
AT) к PHK-полимеразе бактериофага Т7.
Штамм получают следующим образом.
Восьминедельпых мышей линии
BALB/Ñ иммунизируют в пятки задних.„Я0.„164Î158 А 1
3 . 1640158 а
5Î ченные из селезенки иммунной мыши.
Одновременно мьппам подкалывают по
30 мкг антигеиа внутрибрюшинно. Че.тыре дня спустя после трансплантации лимфоцитов ставят слияние.
Титр антител, специфичньу к ДНКзависимой РНК-полимераэе бактериофага Т7, составляет в сыворотке подопытной иаши 1:2000 при определении с помощью. твердофазного иммуноферментного анализа.
Слияние спленоцитов с клетками мышиной миеломы линии Х63.АГ8.653 проводят с помощью ПЭГ фирмы "Nerk" (ФРГ) с мол.массой 4000. Отношение числа клеток миеломы к числу спленоцитов составляет 1:1. После слияния клетки вносят в лунки 96-луночных панелей. За сут до слияния в лунки
96-луночных панелей высаживают селе" зеночные клетки (2 млн кл./мл по
100 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов проводят на среде ГАТ (МСх1ef ieM, Х M. Science, 1964, 25
v. 145, р. 709-710), приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки и
40 мкг/мл антибиотика гентамицина.
Клетки культивируют в инкубаторе с
6%-ным содержанием CO в атмосфере. îны гибридных клеток появляются через неделю в 60 лунок.
Через 14-17 дней тестируют культуральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специфических ан35 тител методом непрямого твердофазного нммуноферментного анализа.
Клонирование положительных куль; тур проводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на одну лунку 96-луночного нлейта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон ИМБ-7С отобран как лучший проду9 цент моноклональных антител и повтор- 45 но клонирован по той же схеме, что и в первый раэ. Один иэ реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100 . привитых мышей
БАЕВ/С, назван ИМБ-7С>.
Штамм клеток ИМБ-7С, депонирован во Всесоюзной коллекций клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером .ВСКК(ХХ) 9 352Д.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки, Суснензионная культура, состоящая из крупных округлых клеток с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные, по 1-2 в ядре.
Культуральные признаки. Среда для культивирования — среда ДМЕМ с сывороткой эмбриона коровы (10%), сывороткой новорожденных телят (10%), глютамином:(2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (0,05 ммоль), пенцилин/стрептомицином (1000 ед/мл). Характер роста— стационарная суспензия. Метод сня- . тия — встряхивание. Частота пассирования 2-3 раза в неделю. Посевная доза 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассев а 5-1 0 раз.
Контаминация. Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.
Культивирование in vivo. Культура прививается и растет в виде асцита в неритонеальной полости мышей
ВИВ/С. За 7 дней введения клеток иьппам-реципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через
10-14 сут после введения 1-5млн клеток.
Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивmr. На протяжении 30 пассажей клона
ИМБ-70 интенсивность продукции антител не изменялась (титр антител по ELISA в культуральной среде 10
d а в асцитической жидкости 2 х 10 ).
Ман AT относятся к классу иммуноглобулинов G1.
Консервация клеток. Клетки ИМБ-7С заморожены на 36-м пассаже. Общее количество ампул 20, по 4 млн клеток в ампуле. Криозащитная среда — рос-товая.
Пример 1. Культивирование гибридных клеток ИМБ-7С, .
Во флаконы для культйвирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200тыс клеток в 1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки коровы, 10% сыворотки новорожденных телят, 2 ммоль глютамина, 1 ммоль пирувата натрия, 0,05 ммоль 2-меркаптоэтанола, 1000 ед./мл пенициллина/стрептомицина. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном состоянии при
37 С в атмосфере 6% СО . Концентрация клеток, превьппающая 1 млн в 1 мл, неблаго"приятна для роста клеток и вызыв ает их гибель. Культуральную тометра.
Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой, специфически обнаруживают ДНК-зависимую PHK-полимеразу бактериофага Т7.
Корректор. N. Демчик ъ
Заказ 997 Тираж 378 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101
5 16401 жидкость из флаконов с трехдневной; культурой тестируют на присутствие
Мон AT. При посеве клетки встряхивают, разбавляют ростовой средой до указанной концентрации и разливают
5 по флаконам.
Пример 2, Культивирование гибридомных клеток ИМБ- Cg e
Кле тки. растущие в культур альных флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при
800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации, не превышающей 500 тыс/мл, т.е.находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный осадок после центрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью 20 трипанового синего. Доводят концентрацию клеток до 1-10 млг/мл и вводят в брюшную полость мышей ВАЬВ/С, предварительно обработанных пристаном.
Обработку проводят однократно за 1—
3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл пристана. Через 1-3 недели (зависимости о т числа введенных клеток) образуюся аспитные опухоли у 1003 привитых мышей ВА1.В/C, Количе ство асцитной жидко сти„накапливающейся в брюшной полости мышей после введения им гибридомных клеток ИМБ-7С (в среднем по 20 животным), составляет 5 мл.
Содержание Мон AT a 1 мл асцитной
35 жидкости составляет 10-20 мг.
Пример 3. Использование моноклональных антител PNB-7С ммуноферментном анализе °
Для о пре деления ак тив но сти в з анмо, действия ИМБ-7С с антигенными детерминантами ДНК-зависимой РНК-поСоставитель A.Ìàíûêèí
Редактор H.Äåðáàê Техред Л.Олийнык
58 6 лимеразы бактериофага Т7 применяют метод непрямого твердофазного анализа. В качестве твердой фазы используют 96-луночные пластины, сенсибилизированные РНК-полимераэой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл раствора на 1 лунку). Далее в лунки пластин вносят по 1 00 мкл раствора астической жидкости в необходимом разведении в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, соде ржащем 150 мм ИаС1, рН
7,4 (ЗФР) . Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до О, 1 Е де те ргена Тв ин-20 (ЗФР-Т) и до 0,2/ бычьего сывороточного альбумина. Пластины инкубируют ч при 37 С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащим 0,05Х ЗФР-Т.
После этого в лунки вносят по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена и инкубируют 1. ч прн 37 С. о
После шестчкратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат (0,005N 2,2-азино-ди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфонаi) (Н ) < и 0,01Х-ную
Н.,О в 0,5 М цитратном буфере (рН
4,0) ° Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при
405 нм с помощью восьмиканального фо-
Фо рмула изо бре тения
Штамм гибридных культивируемых кле- . ток животных Nus muscuIus L HCKK(II)-352 Д,используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой PHKполимеразе бактериофага Т7.
