Штамм культивируемых гибридных клеток животных мusмusсulus l - продуцент моноклональных антител против в-лимфоцитов крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано для определения В-лимфоцитов коров „ Цель изобретения - получение штамма культивируемых гибридных клеток , продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против IgM коровы UTOMM получают гибридизацией клеток миеломы РЗ.Х63 Ag8u653 с клетками селезенки мышей Balb/c, иммунизированных лимфоцитами крови коров, больных хроническим лимфолейкозом.Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками, Штамм прививается in vivo в сингенних мылах в виде асцитной опухоли, Птамм проду щруют монАТ класса IgG2b. НонАТ направлены против IgM, находящегося на поверхности клеточ и растворимого в сьшоротке, МонАТ провляют 1унтотоксическое действие в отношении В-лимфоцитов. Титр монАТ в культуральной жидкости 128, в асцитной жидкости 2048, 1Лтамм депонирован под номером ВСКК(П) К1 295D 5 Кл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ГРИ ГКНТ ССОР (21) 4621764/13 (22) 19.12.88 (46) 30.04.91. Бюп. 2 - 16 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Г.1). 21икалаускене, 21.21. 21аурицас, И.П. Думалакене, К.А. Ннанаускас и В„И. Томошюнас (53) 578.085.23(088„8) (56) Vef. Irnnunology and 1гшпггпорасЬ., 1988, 18, р. 201-212.

1 (54) НТА2121 КУЛЬТИВИРУН1ЫХ П1БРИДНЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ 21US21USCIILIIS L — ПРОДУЦЕНТ 21ОНОКЛОНАПЪНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ

В-ЛИ2ФРОЦ11ТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано для определения В-пимфоцитов коров. Цель изобретения — получение штамма культивируемых гибридных клеИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано дпя определения В-лимфоцитов коров.

Цель изобретения — получение штамма культивируемых гибридных клеток, продуцируюцих монокпонапьные антитела (монАТ) против Ig21 короны„

Цтамм получают следующим образом.

11ьгшейг Ва1Ь/с весом 18-20 г иммуиизируют В-лимфоцитами крови больного хроническим лимфопейкозом крупного рогатого скота (1 РС), В-лиифоциты из крови животных выделяют методом аффинной хроматографии

Иммунизация включает цикл из инъекций В-лимфоцитами (2х10 кл/мл) внут7

„„SU„„1645295 А 1

1g1)g С 12 21 5/00, С 12 Р 21/08

2 ток, продуцируюцих моноклональные антитела (монАТ) против IgH коровы.

22таггм получают гибридизацией клеток миепомы РЗ.Х63 Ag8.653 с клетками селезенки ггышей Ва1Ь/с, иимунизированных пимфоцитами крови коров, больных хроническим лимфолейкозом.Штамм культивируют в среде ДИЕ21 с 10Х сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками. 22тамм прививается in vivo н сингенных ггнпах в виде асцитной опухоли. 11тамм продуцируют монАТ кпасса IgG2b . 21онАТ направлены проФ тин 1с21, находящегося на поверхности кпето:< и растворимого в сыворотке.

ИогАТ провпяют цитотоксическое действие н отношении В-лимфоцитов. Титр монАТ н купьтуральной жидкости 128, в асцитной жидкости 2048. 11таим депонирован под номером ВСКК(П) Р 295D. рибрюшично в полном адъюванте Фрейда. р ига.

В процессе иггмунизации у кивотных on- ©» ределяют титр антител к В-лимфоцитам

1;РС методом тнердофазного И21Ф анали- р за. Выход гибридом, продуцируюцих специйические антитела, наибольший, если дпя слияния берут клетки на 3-5-е сутки после бустерной иммунизации.

Для получения гибридомы используют кле "î÷íóþ линию миеломы РЗх

x63Ag8. 653. Клетки миеломы культивируютт на среде ДМЕ21 с добавлением

10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2 мИ глутаиина, 20 мИ буфера НЕРЕБ, 200 ггкг/ил гентамицина. При гибридизации в качестве слинаюцего агента используют 50Х-ный

1645295 полиэтиленгликоль (ПЭГ) м.м. 1500.

Родительские клетки миеломы P3x63Ag8. .653 применяют в логарифмической фазе росФа. Из селезенки Ва1Ь/с мышей, иммунизированных В-лимфоцитами, извлекают спленоциты. Спленоциты и клетки миеломы промывают трижды в среде ДИЕИ с двукратной концентрацией антибиотика (гентамицина) без смво- 1О ротки. Для слияния смешивают 10 кле7 ток миеломы и 10 лиифоцитов селе8 зенки мьыи Balb/с. Перед слиянием клетки смепивают и совместно осаждают центрифугировакием при 1500 об/мин 15 в течение 10 мин. К осадку клеток добавляют 0,3 мп ПЭГ, тщательно перемешивают и инкубируют 60 с. Далее клетки разбавляют средой ДИЕИ беэ сыворотки. Первые,10 мп среды добав- 20 ляют в течение 10 мин, далее разбавление проводят быстрее, доводя объем до 100 мл. Клетки центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Осадок суспендируют в среде ГАТ с 207 сы- 25 воротки эмбрионов крупного рогатого скота и помещаюг в 96-луночные платы из расчета 1-1 5х10 клеток миеломы на одну лунку. За день до гибридизации в лунки плат помещают макрофаги 30 брюыной полости мышей по 1 ° 10

1 105 клеток в лунку. Платы с клетками инкубируют при 37 С в атмосфере

57.-ной СО . На 14-е сутки среду ГАТ, в которои культивировали гибридные клоны, меняют в ГТ (гипоксантин

1 ° 10 И, тимидин 1 ° 10 М), а затем на

Ф обычную среду культивирования. Клоны, сиитезируюцие антитела, переводят в

24-луночные платы, после чего замора- 40 живают и клоиируют методом предельных разведений в 96-луночных платах. Клетки синтезируюцие антитела (10 —

10 клеток на 1 мп), вводят в брюшную полость мьвией Balb/с, обработанных пристаном (0,5 мп на мьадь внутрибрюшинно) за 4-10 дней до введения клеток для получения асцнтов.

Отбор клонов проводят путем опрь- 50 деления антител к В-лим@оцитам в Иультуральной среде, в которой росли клоны. Антитела определяют твердофазным иммуноферментныч методом. Титр антител в культуральной жидкости состав55 ляет 128. .,Штамм обозначен BBL-D5 и депонирован под номером BCKK(II) У 295D.

1 ультуральные свойства.

Ытани культивируют на ростовой среде Игла в модификации Дульбенко (ДИЕИ) с добавлением 107. эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 20 мИ буфера НЕРЕЯ, 2 иМ глутамина и 50 мкг/мл гентамицина..

Клетки культивируют в суспензии в матрасах объемом 0 5 л; посевная концентрация 10 клеток/мп, кратность

5 рассева 1:6.

Прививка клеток мышам на разных пассажах культивирования стабильно вызывает образование асцитных опухолей у мышей.

Образованию асцита способствует предварительная инъекция лристана животным. Его вводят за 4-10 дней до введения клеток по 0,5 мп на 1 мышь, внутрибрюыинно„ Суспензию гибридных клеток 10 — 10 (4 мл) на 1 мышь также инъекцируют внутрибрюыинно. Опухоли образуются через 7-14 дней после прививки. От одного животного удается получить около 5 мл асцита„ МонАТ высаливают 457-ным раствором сульфата аммония с последующей очисткой на ионнообменной колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Концентрацию иммуноглобулинов определяют в 96-луночных планшетах для микротитрования„ В лунки вносят

20 мкл исследуемого образца и добавляют по 200 икл раствора для определения белка, содержащего 0,017.-ный раствор Кумасси Р-250, 57 этанола и

10Х II>P04. Оптическую плотность измеряют через 5 мин на спектрометре (" Бекман И-8В", CLIA) при длине волны

620 нм. В качестве стандарта для калибровочной кривой используют раствор мыпиного Т8С в концентрации от 0,1 до 0,8 мг/мл. Концентрации стандартного раствора определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм с учетом коэффициента экстинкции. В асците концентрация иммуноглобулинов составляла 5 мг/мл.

Криоконсервацию проводят в среде

ДМЕИ с 50Х сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и 10Х ДИСО. Жизнеспособность эамораженных клеток составляет 72-857. от общего числа клеток.

Характеристика полезного продукта.

Специфичность полученных монАТ определяют с помощью непрямого иммуноферментного (ИМФ) и радиоиммунологического (PHA) анализов. Анализы проводят на лнмфоцитах, выделенных

16 из периферической крови здоровых (НЛ) и больных хроническим лимфолейкозом (ЛЛ) коров. Полученные ИКА проявляют специфичность в 5-6 раз выше к ЛЛ, чем к нормальным, а также специфически реагируют с белками сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), а именно с Тф?, выделенным из сыворотки KPC.

Для исследования молекулярной специфичности монАТ, продуцируемых штамюм BBL-Dg, приготавливают колонку с иимуносорбентом. В качестве носителя берут сефароэу 4В, активированную бромцианом. На 1 мл егля берут 6 мг очищенных из асцитной жидкости. На приготовленный иммуносорбент наносят меченые <

0,1 ?! боратным буфером рН 8,3„ Специфически связанные белки элюируют

0,2 И НС1-глициповым буфером, элюат нейтрализуют 1 М NaOH и диализируют против ФСБ.

Иодирование белков клеточной поверхности проводят с помощью лактоперокси;!азы. В суспензию клеток

5-!Ох!0 в 1 мл ФБС добавляют

100 мкл лактопероксидазы (2 мг/мп), 40 ??Бк Na J и 100 мкл О,ОЗХ Н О

Смесь инкубируют 4 мин, осFopoxHo перемешивая, и опять добавляют !

00 мкл О,ОЗХ Н О . Через 4 мин инкубации клетки 3 раза проьывают

ФСБ и лизируют 0,5Х-ным раствором дезоксихолата натрия на боратном буфере, рН 8,3, имеюцим 1 мИ PMSI (уенилметилсульфонилфторида). Эффективность мечения белков устанавливают с 10Х-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Установлено, что иммуносорбент с Ml> специфически связывает

0,79Х белков, снятых с НЛ, и 1,36Х белков, снятых с ЛЛ. !

Элюат с специфически связанными белками исследуют с помощью электро1 фореза в столбиках полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН). Используют 7,5Х и 102 полиакриламидные гели. В качестве буферной системы используют 0,025 М грис, 0,192 М глицина, О ° 1Х ДСН ° рН 8,3. Белковые пробы перед электрофорезом разбавляют буфером нанесения в соотношении 4: 1 и инкубируют в течение 2-3 мин в кипяцей водяной бане.

45295 ь

Буфер нанесения готовят, смешивая -..

0,5 ?1 трис-HCl,.рН 6,8, 0 ° 9 мп 87Х глицерина, 1,6 мл 10Х ДСН, 0,4 мп

2-меркаптоэтанола, 0,2 мп 0,015Х бромфенолового синего и дистиллированной воды до конечного объема 8 мп.

Электрофореэ в концентрирующем геле проводят при постоянном токе 17 мА на !

О гель. При переходе краски в разделяющий гель силу тока увеличивают до 25 мА на гель.

Фиксацию и окраыивание геля проводят в течение часа в растворе, содер15 жащем 25Х этанола, 10Х уксусной кислоты и 0,1Х красителя,Кумасси

P-250. Гель отмывают в 25Х-ном водном растворе этанола с 10Х-ной уксусной кислотой. В качестве маркерных белков используют комплект маркерных белков для электрофореза: фосфорилазу (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоновую ангидраэу (30 кДа),-ингибитор трипсина (20,1 кДа), и -лактальбумин (14,4 кДа), Пластинки гелей с мечен.ными

Установлено, что иммуносорбент специфически связывает поверхностные белки лимфоцитов, которые имели молекулярную массу около 83-90 киподаль3 тон. Иэ литературных данных известно, что такую молекулярную массу имеет

40 тяжелая цепь поверхностного нммуноглобулина М.

Для проверки проводят ИФА отдельных классов иммуноглобулинов, очищенных иэ сыворотки крови КРС. В лунки

45 96-луночной пластинки разливают по

100 мкл отдельных классов Ig (IgM,, IgG 1 и IgG 2, концентрация 10мкг/мл) в карбонатном буфере рН 9,6. Пластинки инкубируют 3 ч при комнатной тем50 пературе, жидкость стряхивают, лунки блокируют 0,4Х-пью БСА 1 .ч при 37 С и отмывают 5 раэ ФСБ с 0,05Х-ньм твин-20. После инкубац ш с монАТ (1 ч при 37 С) и с антителаю и к Ig машей, мечеными пероксидазои, получают, что монАт специфически связывает только

Ig? f.

Установлено, что монАТ связывают

Igloo KPC, но не реагируют с IgH, вы1645295

-! .n!:!!!ii iк>нЛТ, продуцируемые штаммом

ВВ1,-I) опознают специфические детера

5 м>ш illa!! >Ia иолекуле Ig11, свойствен;s»e только IgH y KPC.

Определение класса и подкласса л!онАТ проводят ии>гуноферл!ентным методомо Г1онЛТ BBL-D) принадлежат K I p клас(у IgG2b.

11ри культивировании клеток штамма

BBI.-D in vivo в мышах линии Balb/с от одной иь>>п! получают 1-5 мл асцит>!О>! жидкости, Из 1 NJ! асцитнои жид кости получено 5 иг ИКа. Титр антител в асцитной жидкости составляет ,>04Д, Игал>м хранится в специализирован>!>> ро>!>!тон определяют с помощью

0,1l5>7.-ного раствора трипанового си-! (eI о

Суспензию клеток (1х10 мп) по

0 л!кл разливают в лунки 96-луночной плоскодонной пластинки. Пласгинки лег,о встряхивают, чтобы клетки равномерно распределились на дне лунок, и о 55 высушивают в термостате при 37 С. 1 ание пластинки с прикрепленными клетка>а! л!ожно хранить длительное время при +4 С. Перед использованием лунки о

50 ноп коллекции KJlpточных культур инсти->0 тута Цитологии АН СССР— ВСКК.

Рег>!страционны>! номер депонироваш!я B(:КК(П) K - 295 D.

Ис >н>льзование штамма иллюстрируется с>!едуюцим прииером. Использо- 25 . наш!я >>онЛТ BBL D в мс тодах ИФА и

РИЛ для определен>!я взаимодействия

>! > !ЛТ с клетками периферической ! ропп здоровых коров H 6l>JibHbl>! JIHM

<;ю.!с!">>!озои, а также с клетками из 3р рзэ>в!т!п>,>х лоифоидпых органов (тимуIc,!, костного мозга, э>>брионпых лимs,!oy !лон и селезенки) .

1 р >! м е р. Для определения спеф! !>!ос ги монЛТ методом ИФА в асцитпой > з!дкости и после их выделения иэ

>и р.!!>>ерическо>! крови здоровых и боль-!

>ых хроническим лимфолейкозом коров и! г.!.о!лг! Ииифоциты при 4 С в градиено ! е 11;!отности 1 7>»oro Верографина. 40

11>,!де:!енные клетки трижды отмывают

1>ос! >а тно-соленым буфером (ФСБ) рн 7, 2

< ус! енд>!руют до концентрации а

1; 10" клеток/ил. Для экспериментальн>>," .!сследований используют суспензии 45 ,ill! к>оц>!тов, содержащие не менее 907, пчых клеток. Циэнеспособность регидратируют с 100 мкл ФСБ в течение 10 мин„ В лунки добавляют по

100 икл ФСБ, имеющего 10 БСА, и инкубируют пластинки 1 ч при 37 С. Пласо тинки отмывают 5 раэ ФСБ, содержащим

0,05 твин-20„ В лунки вносят по 50 мкл ионАТ и контрольных сывороток: сыворотку мы>зей, иммунизированных ПП (по-" лоиительный! контроль), и сыворотку здоровых мышей линии Ва1Ь/с (отрицагельный контроль) в разведении 1:1000.

Пластинки с антителами инкубируют при коинатной температуре 3 ч, а затем оставляют на ночь при +4 С„ Пластино ки вновь отмывают описанным выше способом и в лунки вливают овечьи антитела к Ig мышей, меченые пероксидаэой, н разделении 1:1000 B ФСБ с 17

БСА. Пластинки инкубируют 1 ч при о

37 С, отиывают 5 раэ и в каждую лунку вливают по 100 мкл субстрата ЛБТС (2,2-азино-диазтилбензтиозолинсульфата). Пластинки инкубнруют 20 мин при о, 37 С в темноте. Реакцию останавливают добавлсниеи 100 мкл 2,1т".-ного раствора лимонной кислоты. Учет результатон проводят спектрофот!;>метром при длине волны 416 нм. На основе результатон анализа устанавливают,что титр асцитной >жидкости составляет

2048, а оптииальная концентрация очищенного монЛТ вЂ” 2-5мкг/мл.

Для определения специфичности монЛТ иетодои радиои>!иунологического

a»aJIIlsa (РИА) клетки лии!,>оидных органон и .и!>!фоциты периферической крови (10 /ил) разливают по 100 мкл н каждую лунку и добавляют по 100 мкл ИКА или контрольных антисывороток. Инкубируют 1 ч при 37 С и на ночь при 4 С. о о

После инкубации пластинки центрифугируют при 1500 об/мин 5 м!и, супернатант отсасывают, клетки 5 раз промывают ФСБ, В ка>дую лунку вносят по 50 мкл (50 Ä 000 иип/мин) иеченых " J овечьих антитеп против Ig IIIlueII ("Amersham", Англия) и инкубируют 1 ч при 37 С. о

После инкубации клетки нроиывают 5 раз

ФСБ и определяют радиоактивность.Как иетод ИФА, так и РИА показал, что монАТ связываются более интенсивно с л>!>кроцитами коров, больных лейкоэом, чеи здоровых„

Полученные результаты в РИА на клетках разных лимс .юидных органов взрослых коров и их эибрионон также поаааываот, то нанболаанй пропоет

1645295

Составитель Г. Игнатьева

Редактор Л. Маковская Техред М.Дидык Корректор М. Шароши

Заказ 1322 Тираж 380. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101 реактивности дают клетки эмбриональных лимфатических узлов и селезенки, а также клетки костного мозга взрослых коров, где преобладают клетки В5 типа.

Кроме того, монЛТ обладают цитотоксическим действием в отношении В-лимфоцитов, а также используются в методе

ИюЛ для определения уровня растворимого 1ф1 в сыворотке коров. ормула изобретения

1,1тамм культивируемых гидридных клеток животных Жвпывсц1цв L

ВСЕК(П) Р 295 D — продуцент моноклональных антител против В-лиироцитов крупного рогатого скота.