Способ обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть применено при диагностике инфекционных и наследственных болезнейЦель изобретения - упрощение и ускорение способа . Установлена возможность использовать антитела к конкретному гаптену для выявления любого гаптенизированного комплекса нуклеиновой кислоты с этим гаптеном, конъюгировать антитела к гаптену с иммуноферментной меткой для реакции гибридизации , а обработку продукта взаимодействия индикаторной и исследуемой последовательностей оснований проводить непосредственно конъюгатом с иммунохимической меткой.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С12 0 1/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4626326/13 (22) 25,12.88 (46) 30,06.91. Бюл. ¹ 24 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) И.В. Домарадский, А.В. Дроздов, В.Н. Злобин и А,Л. Мельников (53) 577.15:66.683.18 (088,8) (56) Proc. Nat, Acad. Scl, 1984, 81, р. 3466—

3470, (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГOMORQГИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, может быть использовано при диагностических исследованиях в научно-исследовательских работах, Цель изобретения — упрощение и ускорение способа.

Для этого антитела против гаптенизированной индикаторной последовательности получают иммунизацией животного любым гаптенизированным фрагментом нуклеиновой кислоты, антитела коньюгируют с их иммунохимической меткой, а обработку продукта взаимодействия гаптенизированной индикаторной последовательности и исследуемой последовательности осуществляют непосредственно конъюгатом.

Пример 1. Для модификации ДНК с помощью N-ацетил-N-ацетокси-2-аминофлюорена (АААФ) 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют в 5 мл 2 мМ

„„5U„„1659487 А1 (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть применено при диагностике инфекционных и наследственных болезней. Цель изобретения — упрощение и ускорение способа, Установлена воэможность использовать антитела к конкретному гаптену для выявления любого гаптенизированного комплекса нуклеиновой кислоты с этим гаптеном, конъюгировать антитела к гаптену с иммуноферментной меткой для реакции гибридизации, а обработку продукта взаимодействия индикаторной и исследуемой последовательностей оснований проводить непосредствен но конъюгатом с иммунохимической меткой. натрий-цитратного буфера (рН 7,0) и денатурируют кипячением в течение 10 мин. К раствору ДНК добавляют 5 мл раствора

АААФ в 40%-нам этиловом спирте с концентрацией 1 мг/мл. Инкубируют при 37 С в темноте в течение 3 ч. Нерастворенный

АААФ удаляют центрифугированием (1000 g, 5 мин, 20 С). Очистку супернатанта от АААФ проводят пятикратной экстракцией эфиром. К раствору добавляют 3 мл 3

M ацетата натрия (рН 4,8) 20 мл этилового спирта и выдерживают 2 ч при -20 С. Осадок

АААФ-ДНК собирают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 20 С) и растворяют в физиологическом растворе в концентрации 0,6 мг/мл.

Иммунизацию кроликов проводят смесью модифицированной ДНК (АААФДНК) с метилированным бычьим сывороточйым альбумином (МБСА). Для одной

1659487 инъекции смешивают 0,4 мл раствора

АААФ-ДНК, 0,1 мл 0,25%-ного раствора

МБСА, 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда.

Смесь вводят в подушечкую лапы кролика четыре раза с недельным интервалом. Затем с недельным интервалом делают три внутривенных инъекции смесью АААФ-ДН К с МБСА без адъюванта. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь.

Сыворотку крови отделяют центрифугированием (1000g, 10 мин, 20 С) и разводят физиологическим раствором в отношении

1:1. К 10 мл сыворотки добавляют 10 мл насыщенного раствора сульфата аммония и выдерживают при 4 С в течение 10 ч.Центрифугируют (5000 g, 10 мин, 4 С), осадок растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Выдерживают при

4 С в течение 10 ч и центрифугируют (5000 g, 10 мин, 4 С). Осадок анти-ДНК иммуноглобулинов растворяют в 1 мл физио. логического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4 С против физиологического раствора, затем лиофилизируют.

Для получения конъюгата пероксидазы хрена с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами 5 мг пероксидазы хрена растворяют в

0,45 мл 0,1 M карбонатного буфера (рН 9,3) и добавляют 0,05 мл 0,05 M раствора периодата натрия, Раствор активированной пероксидазы смешивают с 1,5 мл раствора анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинов в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,3) с концентрацией 10 мг/мл. К смеси добавляют 300 мг сухого сефадекса G-25 и выдерживают 3 ч в темноте, сефадекс удаляют фильтрацией. К фильтрату добавляют 0,4 мл раствора боргидрида натрия с концентрацией 5 мг/мл, Инкубируют при 4 С в течение 2 ч, затем доводят объем физиологическим раствором до 2,5 мл и прибавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Выдерживают при 4 С в течение 10 ч. Центрифугируют (5000 g, 10 мин, 4 С). Осадок конъюгата пероксидазы с анти-АААФ-ДН К иммуноглобулинами растворяют в 1 мл физиологического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4 С против физиологического раствора.

Добавляют глицерин до 50%-ной концентрации. Срок годности препарата не менее 1 года при температуре 5 3 С, Полученный конъюгат пероксидазы с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами используют для выявления АААФ-ДНК. На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 10 мкл растворов АААФДНК с концентрациями 10 мкгlмл, 1 мкг/мл, 100 мг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл, 100

50 пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной немодифицирован ной ДН К (из тимуса теленка) в тех же концентрациях. Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин.

Препарат конъюгата пероксидазы с антиАААФ-ДНК иммуноглобулинами разводят в отношении 1:200 фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 7 MM фосфорнокислого двухзамещенного натрия, 3 мМ фосфорнокислого однозамещенного натрия, 120 мМ хлористого натрия, 0,3% твина-20, 1,5 мг/мл яичного альбумина, рН 7,4, Фильтр с иммобилизованным ДНК выдерживают в течение 30 мин в буфере ФСБ, затем 1 ч B растворе коньюгата, разведенного в отношении 1;200 буфером ФСБ, Промывают фильтр три раза по 5 мин буфером

ФСБ и окрашивают погружением его в раствор хромогенного субстрата, содержащий

0,2%-ный раствор бензидина в зтиловом спирте, 10%-ный от насыщения раствор хлористого аммония. 20 мМ ЭДТА, рН 6,0, 0,3%-ный раствор перекиси водорода. Через 20 с положительные пробы окрашиваются в ярко-голубой цвет.

Конъюгат пероксидазы с анти-ДНК иммуноглобулинами выявляет не менее 10 мг

АААФ-ДН К и не реагирует с немодифицированной ДНК.

Пример 2. Для модификации ДНК сульфированием 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют s 7 M мочевине до концентрации 1 мг/мл и денатурируют кипячением в течение 10 мин, К раствору ДНК добавляют 10 мл 3 M раствора 0-метилгидроксиламина (рН 6,0) и 15 мл 2 M раствора метабисульфита натрия (рН 6,0). Инкубируют при 37 С в течение 8 ч затем диализуют против дистиллированной воды в течение

18 ч при 4 С, Добавляют 3 мл 4М ацетата натрия (рН 4,8) и 75 мл этилового спирта, выдерживают при -20 С в течение 2 с.

Образовавшийся осадок сульфированной ДНК (С-ДНК) собирают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 20 С) и растворяют в физиологическом растворе в концентрации

0,6 мг/мл.

Иммунизацию кроликов, выделение анти-С-ДНК иммуноглобулинов, получение конъюгата пероксидазы хрена с анти-СДНК иммуноглобулинами проводят по примеру 1, Полученный коньюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами используют для выявления С-ДНК. На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 10 мкл растворов С-ДНК с концентрациями 10 мкг/мл, 1 мкlмл 100 нг/мл, 1 нг/мл, 100 пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной, немодифицированной ДНК (из тимуса теленка) в тех же концентрациях.

1659487 лает его экономичнее при сохранении высокой специфичности и чувствительности, Формула изобретения

Составитель Т. Забойкина

Редактор M. Петрова Техред М.Моргентал Корректор Т.Колб

Заказ 1821 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин, Обработку фильтра коньюгатом пероксидаэы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами и окрашивание образующихся комплексов проводят по примеру 1.

Конъюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами действительно выявляет не менее 100пг С-ДНК и не реагирует с немодифицированной ДНК, Таким образом, данное техническое решение значительно упрощает способ, так как универсальные антитела к применяемому гаптену могут быть получены заранее и, таким образом, отпадает необходимость каждый раз получать их к различным комплексам нуклеиновая кислота-гаптен. Кроме того, использование для гибридизации конъюгата антител к гаптену с иммуноферментной меткой исключает использование анти-антител и позволяет применять антитела любого происхождения. Обработка продукта конъюгатом значительно упрощает способ, сокращает время на его осуществление, снижает трудоемкость способа. деСпособ обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей, включающий проведение гаптенизации последовательности ДНК и получение антител

10 против гаптенизированной последовательности ДНК, конъюгата с иммуноферментной меткой. проведение ДН К-ДН К гибридизации с гептенизированным

ДНК-зондом, регистрацию гомологичных

15 последовательностей с помощью,иммуноферментной реакции, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, проводят иммунизацию животных гаптениэированной произвольной последо20 вательностью ДНК, антитела против гаптенизированной последовательности ДНК конъюгируют непосредственно с иммуноферментной меткой, а иммуноферментную реакцию осуществляют непосредственно

25 этим конъюгатом.