Штамм бактерий bacillus suвтilis - деструктор поликапроамидных волокнистых материалов на уровне макро-и микроструктуры
Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий - деструктора поликапроамидных (ПКА) волокнистых материалов и может быть использованодляохлаждения микробиологической стойкости текстильных материалов, содержащих в своем составе ПКА волокна. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-1676Д (К1), обладающего высокой биологической активностью по отношению к ПКА-волокнистым материалам и способного вызывать гидролиз макромолекул ПКА с образованием Ј - аминокапроновой кислоты (Е-АКК). При выдерживании штамма в течение месяца при 35-37°С и влажности, близкой к 100%, на ПКА-волокна показатель биодеструкции волокна составляет 0,67. При выращивании штамма в среде, содержащей ПКА волокно в качестве единственного источника углерода и минеральные соли, при 35-37°С на 5-е сут образуется 32,3 мг/л Е-АКК. 3 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ е (21) 4655826/13 (22) 27,02.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Ленинградский институт советской торговли им. Ф. Энгельса (72) И.А, Ермилова, Е,Л. Пехташева и Е.В.
Ермилова (53) 663 15(088.8) (56) Ермилова И.А. Теоретические и практические основы микробиологической деструкции текстильных волокон и способов их защиты от воздействия микроорганизмов. Диссертация ЛИТЛН им. С.M. Кирова, Ленинград, 1982.
ГОСТ 9.049-75.ЕС ЗКС. Материалы полимерные. Методы лабораторных испытаний на устойчивость и воздействие плесневых грибов. M.: Иэд-во стандартов, 1978, 6 с. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BAClLLUS
$0ВТ!ОЗ-ДЕСТРУКТОР ПОЛИКАПРОАМИДНЫХ ВОЛОКНИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ
НА УРОВНЕ МАКРО- И МИКРОСТРУКТУРЫ
Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий— деструктора поликапроамидных (0KA) волокнистых материалов и может быть использовано для определения микробиологической стойкости текстильных материалов, содержащих в своем составе ПКА волокна.
Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtllls ВКМ В1676Д (К1), обладающего высокой биологической вктивностью по отношению к ПКА волокнистым материалам и способного вы„„ Ы„„1б59473 А1 (я)5 С 12 N 1/20, С 12 Q 1/18 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий— деструктора поликапроамидных (ПКА) волокнистых материалов и может быть использовано для охлаждения микробиологической стойкости текстильных материалов, содержащих в своем составе ПКА волокна. Целью изобретения является получение штамма бактерий
Bacillus subtilis BKM В-1676Д (К1), обладающего высокой биологической активностью по отношению к ПКА-волокнистым материалам и способного вызывать гидролиз макромолекул ПКА с образованием я - аминокапроновой кислоты (Е-АКК). При выдерживании штамма в течение месяца при 35 — 37 С и влажности, близкой к 100 g„ на ПКА-волокна показатель биодеструкции волокна составляет 0,67, При выращивании штамма в среде, содержащей ПКА волокно в качестве единственного источника углерода и минеральные соли, при 35 — 37 С на 5-е сут образуется 32,3 мг/л Е-АКК, 3 табл. эывать гидролиз макромолекул ПКА с образованием S-аминокапроновой кислоты.
Штамм выделен иэ поврежденного микроорганизма капронового волокна. Штамм хранят в чашках Петри на стерильных ПКА . волокнах при 100 влажности и температуре 35-37 С.
Штамм имеет следующую характеристику.
Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, размером 0,7-0,8 2-3 мкм. Подвижные.
Реакция по Граму положительная. Образуют эллиптические по форме эндоспоры, ко1659473 торые располагаются в центре, раздутости спорангия нет. (На мясопептонном агаре (37 С, 48 ч) образует округлые крупные, плоские колонии. Поверхность колоний бороэдчатая, радиально исчерченная. Колонии серого цвета матовые; мелкоскладчатый центр — беловатый; край волнистый, структура струйчатая.
На мясопептонном бульоне (37 С, 44 ч) беэ встряхивания рост без помутнения среды, на поверхности образуется складча7обугристая кожистая пленка.
Синтетическая среда с минеральным азотом, г/л: глюкоза 3,0; ИН4ИОэ 0,3;
КНгР04 0,1; КгНРО4 0,1; MgS04 0,05; NaCI
0,05; СаСОэ 0,5; FeSO4 0,0002; агар-агар
15,0. Образует средние круглые; выпуклые в центре колонии, Поверхность колоний радиально исчерченная. Колонии матовые, белые, средняя часть колонии более темного цвета; край лопастной, структура струйчатая. На ломтиках картофеля (37 С, 48 ч) образует морщинистую мелкоскладчатую пленку кремового цвета.
Физиолого-биохимические признаки.
Отношение к источникам углерода, Хорошо усваивает и растет на глюкозе, арабинозе, ксилозе, манните: образует иэ них кислоту. Не образует газа из глюкозы. Образует ацетоин.
Отношение к источникам азота: нитраты восстанавливает до нитритов; индол не выделяет. Молекулярный азот не использует, Тироэин не разрушает. Фенилаланин не дезаминирует, В дополнительных факторах роста не нуждается. Желатину разжижаю .
Крахмал и казеин гидролизуют. Каталазоположительный. Растет на среде с 7 g, NaCI.
Облигатный аэроб.
Температурный диапазон роста: от +5 до 55 С; оптимальная область 29 — 38 С, Оптимум рН 6,7-7,1, Штамм вызывает нарушение структуры
ПКА волокон на уровне макро и микроструктуры.
Деструкция на уровне макроструктуры, контролируемая с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, проявляется в разориентации кристаллических областей; расслоении фибрилл до отдельных макромолекул; разрушении кристаллических областей до аморфного состояния.
На основе получения данных выявлено, что показатель биодеструкции (К) в интервале 0 С помощью ИК-спектроскопии, полярографии и ЯМР— спектроскопии доказана деструкция макромолекул поликапроамида: 55 образуется 6 -аминокапроновая кислота; происходит разрыв углеродных цепочек. Выявлено что эти изменения в микроструктуре волокна соответствуют показателю биодеструкции в интервале 0,30<К <45,0. Оценку биодеструкции проводили следующим образом, Для, этого под микроскопом выявляли типы повреждений волокон в зависимости от нарушения структуры и рассчитывали по совокупности абсолютных и относительных повреждений и показателя биостойкости степень деструкции волокон (K). Показатель биодеструкции (К) рассчитывали пс следующей формуле: K(Xl; Хг; Хэ)= а Х1+ а Хг+ а Хэ. где М-X +Xz+X3; N — полное число повреждений; Х1 — число повреждений класса А; Хг — число повреждений класса В; Хэ — число повреждений класса С; а = 0,002 — коэффициент веса повреждений класса А; аг=- 0,025 — коэффициент веса повреждений класса В; с = 0,255 — коэффициент веса повреждений класса С. Повреждения класса А характеризуются с .вокупностью начальных изменений поверхности волокна в виде обрастания микроорганизмами и продуктами их обмена, слабой пятнистости и испещренности. Повреждения класса А не влияютна изменение внутренней структуры и свойств волокна. Однако при обнаружении этих начальных стадий деструкции можно судить о возникновении процесса повреждения, который в определенных условиях может прогрессировать. Повреждения класса В обьединяют более сильные проявления деструкции: глубокую испещренность, вэдутия, утонения, повреждения стенки. Подобные повреждения влияют не только на изменение структуры, но и на изменение свойств волокна: падает механическая прочность, увеличивается удлинение при разрыве. Для повреждений класса С характерны такие виды, как расслоение, глубокое местное повреждение стенки, распад до отдельных конгломератов. Появление таких повреждений свидетельствует о глубокой биологической деструкции структуры волокна на всех ее уровнях. Изменение показателя биодеструкции в интервале 0<К 0,3 соответствует начальным изменениям поверхности волокон; в интервале 0,3 «К 3,55 — деструкции не только поверхности, но и внутренних участ1659473 15 ков волокон, сопровождающихся изменениями его; в интервале 3,55 К «42,25- глубокой деструкции структуры волокон на всех уровнях. 5 Определяли биостойкость ПКА волокон, нитей, нетканных материалов при воздействии на них известного стандартного набора микроскопических грибов и предложенного штамма бактерии. Штаммы, входящие в из- 10 вестный набор тест-культур, следующие: АзрегдН!оз niger 31 —.СЭ A„terreus 8254 Aureobasldium, pullulans 1116 Paecllomyces variotii 1749 Penlclllium Henlculosum 61-ГЗ P. ochro-chio ron 1702 Scopulariopsls brevlcauils 19 — ИЗ Trlchoderma vlrlde 27 — ИЗ Испытания проводили для грибов при 20 28 С, относительной влажности 90 в течение 1 мес. для бактерий при 35++ 2 С, относительной влажности, близкой к 100, в течение 1 мес. Результаты в табл. 1. Таким образом, при воздействии штам- 25 ма бактерий Вас. subtllis BKM В-1676Д на ПКА волокнистые материалы показатель биодеструкции находится в диапазоне 0,310,67, что соответствует возрождению не только поверхности, но и внутренних уча- 30 стков волокна. Показатель биодеструкции, равный 0,004-0,32, при воздействии стандартного набора микроскопических грибов свидетельствует о начальной деструкции поверхности волокон. 35 Для доказател ьства биодеструкции П КА волокон на уровне микроструктуры при воздействии предложенного штамма бактерий применяли метод полярографии. При деструкции ПКА волокон на уровне микро- 40 структуры происходит гидролиз макромолекул поликапроамида с образованием 8-.аминокапроновой кислоты. Определение образования ь -аминокапроновой кислоты проводят на полярографе 45 ИЧ-1 Гомельского завода измерительных приборов по трехэлектродной схеме относительно насыщенного коломельного электрода. Используют среду следующего состава, в которой поликапроамидные волокна служат единственными источниками 50 углерода, мас,g: KzHPO4 0,3; КНгРО4 0,1; MgSOg 7Н20 0,02; СаС12 0,01; NaCI 0,01; МН4йОз 0,5; ЕеС!з 0,1; поликапроамидное волокно 0.5; NH4CI 0,5. В колбы емкостью 250 мл вносят по 100 55 мл среды, засевают суточной бульонной культурой штамма в количестве 3,1 10 клеток/мл и выдерживают в термостате при 35ОС. Через каждые сутки отбирают пробы, добавляют 5 мл насыщенного раствора, содержащего 1 моль/л бикарбоната натрия, 6 формалина и 0,04ф желатина. Полученный раствор после продувки аргоном поляграфируют в интервале потенциалов Е=8,8+-1,5 норм.к,э. Содержание 6-аминокапроновой кислоты определяют по калибровочной кривой. Данные представлены в табл. 2. Из табл, 2 видно, что максимальное количество ь.-аминокапроновой кислоты выделяется в среду на 5-е сут, после чего содержание ее в среде уменьшается, что связано с потреблением штамма я-аминокапроновой кислоты. При воздействии стандартного набора микроскопических грибов на ПКА волокна выделения Я-аминокапроновой кислоты не. наблюдают. Предложенный штамм можно использовать для оценки эффективности защиты волокон от биоповреждений. С этой целью определяют биостойкость ПКА волокон, химически модифицированных нитрофурилак- . ролеином (НФА). При этом испытаниям подвергают ПКА волокна тониной 0,7 текс (образец 1) и 0,4 текс (образец 2). Данные представлены в табл, 3. Из данных табл. 3 видно, что антимикробные волокна тониной 0,7 текс более бактериостойки сравнительно с волокнами тониной 0,4 текс. Таким. образом, предложенный штамм дает возможность выявить волокна, обладающие большим антимикробн ым эффектом. Пример 1. Предварительно простерилизованные ПКА волокна тониной 0,7 текс помещают в количестве 20 мг в стерильные чашки Петри. Посевной материал получают выращиванием штамма на скошенном мясо-пептонном агаре в течение суток при 35 С. Готовят суспензию бактериальных клеток в концентрации 106 клеток на 1 мл стерильной воды и заражают ею 20 мг волокна. В течение 1 мес волокна выдерживают в термостате при 35 — 37 С. относительную влажность, близкую к 100, поддерживают добавлением 1 мл стерильной воды через каждые трое суток. Затем проводят подсчет показателя биодеструкции (К). ПКА волокна тониной 0,7 текс при.воздействии штамма имеют показатель К=0,67. Для определения образования 6-аминокапроновой кислоты методом полярографии используют следующую среду, в которой ПКА волокна служат единственным источником углерода, : ПКА волокно 0,5; К2НРО4 0,3; КНРРО4 0,1; MgSO< 7Н20 0,02; 1659473 Таким образом, при воздействии штам иа бактерий В. subsllls BKM B-1б7бД на ПКА волокна тониной 0,7 текс происходит деТаблица 1 Степень биоденструкций ПКА волокнистых материалов под действием известного набора микроскопических грибов и штамма бактерий В.subtllls BKM В-1676Д Известный наба r ибов пов еж ение классов, сл.е Штамм В.subtilis ВКМ В-1676 пов еж ение классов, сл.е Образец В 1,3 1,0 6,0 10,7 34,3 10,3 1,3 6,3 0,7 4,3 61,3 1,0 2,0 9,1 1,3 6,3 Таблица 2 Образование я -аминокапроновой кислоты под действием штамма бактерий В.subtills ВКМ В-1676Д на ПКА волокнистые материалы Повреждение П КА волокон,модифи бактерий В. subtills ВКМ В-1676 Д Примечание. Контрольные образцы повреждений не имели, CaCl 0,01; NaCI 0,01; КН4ИОз 0,5; МН4С14 0,5; FeClg 0,1. В колбы емкостью 250 мл вносят по 100 мл среды, засевают суточной бульонной культурой штамма в количестве 3,1 ° 10 клеток на 1 мл и выдерживают в термостате при 35 С. Через каждые сутки отбирают пробы И по калибровочной кривой определяют содержание g-АКК. Максимальное количество 5-АКК 32,3 мг/л у этих волокон отмечено на 5-е сут. ПКА волокна тониной 0,7 текс ПКА комплексные нити тониной 15,6 текс ПКА нетканый материал (тонина волокон 0,4 текс, поверхностная плотность 250 г/м струкция на уровне макро- и микроструктуры. Пример 2. Заражение ПКА нетканного иглопробивного материала поверхностной плотности 250 г/м (волокна тониной 0,4 текс ) осуществляет аналогично примеру 1. Показатель биодеструкции через 1 мес воздействия штамма равен 0,63. Максимальное образование 6-АКК, равное 66,0 10 мг/л, наблюдают на 5-е сут. Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus subtllls BKM В-1676D — деструктор поликапроамидных волокнистых материалов на уровне макро- и 15 микроструктуры.
