Защитная среда для лиофильного высушивания облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состоянии. Цель изобретения - повышение выхода жизнеспособных микробных клеток. Среда содержит, г/л: белок молока 1,8-5,5; трис-солянокислый буфер с рН 6,4 73-91: многоатомный спирт 61-137; бидистиллированная вода до 1 л. В качестве источника белка молока среда содержит жидкое или сухое порошковое молоко, подвергнутое обезжириванию центрифугированием , а в качестве многоатомного спирта - адонит, сорбит или маннит. Среда обладает универсальностью, так как позволяет длительно сохранять в лиофилизированном состоянии микробные клетки независимо от их биохимических особенностей. Допускается хранение лиофилизированных культур без вакуума при комнатной температуре или при высокой остаточной влажности, хотя наилучшие показатели выживаемости достигнуты при хранении под вакуумом при 0-4°С и остаточной влажности 0,5-3,0%. 1 з.п.ф-лы, 2 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<51)5 С 12 N 1/20, 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4701625/13 (22) 07.06.89 (46) 30.05.91. Бюл. N. 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательский а институт антибиотиков (72) M.Â.Òþðèí и Б.А.Шендеров (53) 576.8.093,36(088.8) (56) Методы-общей бактериологии/Под ред.

Ф.Герхардта и др. Т.1, M.: Мир. 1983, с.521. (54) ЗАЩИТНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЛИОФИЛЬНОГО ВЫСУШИВАНИЯ ОБЛИГАТНО АНАЭРОБНЫХ И МИКРОАЭРОФИЛЬНЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состоянии. Цель изобретения— повышение выхода жизнеспособных микробных клеток. Среда содержит, г/л: белок

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состоянии.

Цель изобретения — повышение выхода жизнеспособных микробных клеток.

Защитную среду готовят следующим образом.

Для обеспечения содержания в среде белка молока 1,8-5,6 г/л берут 150-400 мл обрата или 3,0-8,0 г сухого порошкового молока и доводят бидистиллированной водой до 500 мл. Раствор сухого порошкового молока обезжиривают цектрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды растворяют 73 — 91 г трис-основания и доводят до рН 6,4 соляной кислотой плотностью., Ы„„1652336 А1 молока 1,8-5,5; трис-солянокислый буфер с рН 6,4 73 — 91; многоатомкый спирт 61 — 137: бидистиллированная вода до 1 л. В качестве источника белка молока среда содержит жидкое или сухое порошковое молоко, подвергнутое обезжириванию центрифугированием. а в качестве многоатомного спирта— адонит, сорбит или маннит. Среда обладает универсальностью, так как позволяет длительно сохранять в лиофилизированном состоянии микробные клетки независимо от их биохимических особенностей. Допускается хранение лиофилизированных культур без вакуума при комнатной температуре или при высокой остаточной влажности, хотя наилучшие показатели выживаемости достигнуты при хранении под вакуумом при

0 — 4 С и остаточной влажности 0,5 — 3 0 . 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1,18 г/см, затем в полученном буфере растворяют 73-137 r многоатомного спирта и О оба раствора раздельно автоклавируют при, (Я

0,6 атм 45 — 50 мин. После остывания раство- Я ры асептически смешивают в стерильном (,Д мерном стакане и доводят до 1 л стерильной (Ъ бидистиллированной водой. Бактериаль- О ную массу получают на плотных или в жидких питательных средах. Анаэробные бактерии выращивают при 37 С в атмосфере 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа. Защитной средой бактерии смывают с поверхности плотной питательной среды или ресуспендируют в среде осадки бульонных культур микроорганизмов до кокечной концентрации 10 -10 бактерий в

11 одной пробе(3650-300 мкл). Манипуляции с облигатно анаэробными бактериями произ1652336 водят в токе газовой смеси для выращивания анаэробных бактерий. Суспензии микроорганизмов вносят в стеклянную ампулу или другой подходящий сосуд и замораживают в смеси этанол — твердая углекислота в течение 15 — 20 мин. Замороженные пробы помещают в холодную (минус 20 С и ниже) камеру под вакуум 0,01-0,005 атм на 12-18 ч, По окончании высушивания проба содер, жит не более 0,5-3,0 исходного количества воды, После запитывания ампул под вакуумом культуры пригодны для длительного хранения (1 — 2 года и более) при 0 — 4 С без релиофилизации.

Пример 1. Берут белок молока 3,7 г, для чего 275 мл обрата доводят до 500 мл бидистиллированной водой. Параллельно в

300 мл бидистиллированной воды из 82 r трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см готовят трис-соля нокислый буфер с рН 6,4, в котором растворяют 96 г адонита. Растворы автоклавируют раздельно при 0,6 атм 45 — 50 мин. После остывания растворы асептически сливают в стерильном мерном стакане и доводят объем до 1 л стерильной бидистиллированной водой, Полученным раствором смывают с плотных питательных сред культуры микроорганизмов так; чтобы в 150 — 300 мкл суспензии содержалось не менее 10 -10 бактерий.

9 11

Из полученной суспензии готовят 1.0-кратные разведения в свежерегенерированном цистеин-рингеровском растворе и высевают на соответствующие плотные питательные среды для определения количества живых клеток до лиофилизации. Остальное количество суспензии распределяют по

100 — 300 мкл в стеклянные ампулы, взвешивают для определения среднего веса ампул для каждой культуры и замораживают ампулы в смеси этанол — твердая углекислота в течение 20 мин. Замороженные пробы помещают под вакуум 0,01 — 0,005 атм при минус 20 С и ниже на 16 ч. Высушенные ампулы взвешивают вновь, определяя остаточную влажность как разность между средним весом ампул до лиофилизации и после нее. Ампулы запаивают под вакуумом и хранят при 0-4 С. Остаточная влажность проб не превышает 0,5-3,0%. Результаты представлены в табл.1.

Пример 2. Берут белок молока 1,8 г, для чего 3,0 г сухого порошкового молока разводят в 500 мл бидистиллированной воды и центрифугируют при 5000 g, затем удаляют скопившийся сверху жир, сохраняя водяную фазу. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 73 г трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см готовят трис-солянокислый буфер с рН 6,4, в котором растворяют 73 г маннита.

Оба раствора стерилизуют раздельно при

0,6 атм в течение 50 мин. Далее все манипуляции осуществляют согласно примеру 1.

Остаточная влажность проб при этом не превышает 0,5 — 3,0 .

Из полученных данных следует, что защитная среда превосходит известные среды по сохранности лиофилизированных

35 культуроблигатноанаэробныхй микроаэрофильных микроорганизмов, допускает хранение проб под вакуумом при 0 — 4 С в течение длительного времени без существенного снижения выживаемости бактерий, 40 позволяет упростить процедуру хранения без утраты лиофилизированных культур при небольших сроках хранения (от 2 мес до 1 г.), а также обеспечивает хорошую сохранность микроорганизмов различных таксоно45 мических групп, включая облигатно анаэробн ые бактерии.

Формула изобретения

1. Защитная среда для лиофильного высушивания облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов, содержащая белок молока и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода >кизнеспособных микробных клеток, она дополнительно содержит трис-солянокислый буфер с рН 6.4 и многоатомный спирт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Белок молока

1,8 — 5,6

Пример 3. Берут белок молока 5,6 r, для чего 400 мл обрата доводят бидистилли10 рованной водой до 500 мл. Параллельно в

300 мл бидистилпированной воды из 91 r трис-основания и соляной кислоты плотностью 1,18 г/см готовят трис-солянокислый буфер с рН 6,4, в котором растворяют 137 г

15 сорбита. Оба раствора стерилизуют раздельно при 0,6 атм 45 мин. Далее все макипуляции осуществляют согласно примеру t.

В указанных условиях выживаемость культур отличается от значений по примеру 1 не

20 более чем в 10 раз для каждой высушенной культуры соответственно. Остаточная влажность проб не превышает 0,5-0,3, В табл.1 показан видовой спектр облигатно анаэробных и микроаэрофильных бак25 терий, лиофильно высушенных в предлагаемой защитной среде.

В табл.2 показано влияние состава защитной среды на выживаемость анаэробных и микроаэрофильных бактерий после 12

30 мес хранения при 0 — 4 С в вакууме.

1652336

2. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве белка молока она содержит жидкое или сухое обезжиренное молоко, а в качестве многоатомного спирта— адонит, сорбит или маннит, 5

73-91

61-137

До1л

Та блица 1

Срок набшоНоВид микроорганизма мер дения, мес

Кз П?в 24

8 PA 3 24

1 L. acidophilus

2 L. plantarum

3 L. fermentum

4 L. plantarum

90тс 4 24

АТСС 8014 24

L. сая ei,5

103

3 10 бк10

3 «10

L. helvet icus

10 . Ь. jugurti

6 10

3 10

9 "10

24

P. acnes

P. f r cud enr ich i i

16

17 Peptococcus sp.

3 л10

10lo

19

6к10т

1313

33 2

АТСС 33292 2

22

5Х10<

П р и ме ч а н и е. Культуры хранят под вакуумом при 0-4"С, Трис-солянокислый буфер с рН 6,4

Многоатомный спирт

Бидистиллированная вода

6 1.. bгеттй.з

7 ? . buchneri NRRL

8 L. bulgaricus

casei

Streptococcus lactis

S. faccalis

14 Propionibacterium acnes

C lost rid шт sp .

Veillonella parva

Fusobacterium sp.

Capnocytophaga

Campy1o Ьа с t er j ej uni

АТСС 367 24

В 1837 24

8-79 24

АТСС 15009 24

АТСС 521

АТСС 393

MG 4174

2Н2-2Р

73/78

75/79

ВКИ 104

Количество живых бактерий в пробе

6 10s

7 к10в

8к10

2 к10

7 10

7 10

2i10

1652336

Таблица 2

Составитель Г.Смирнова

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор И. Муска

Редактор M,Ïåòðoàà

Заказ 1747 Тираж 384 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

П р и и е ч а н и е. В числителе дано количество микробных клеток (м,кл) в пробе до лиофилизации; в знаменателе — количество микробных клеток в той же пробе после лиофилизации.