Штамм культивируемых клеток тестикул эмбриона быка, используемый для накопления вирусов крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к биотехнологии культуры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота. Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота. Штамм получен из тестикул эмбриона, полученного от здоровой коровы путем переведения в культуру клеток. Регламент культивирования не отличается от общепринятого для культур клеток. Штамм депонирован в коллекции ВСКК /СХЖ/ N 40. Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при физиологических условиях и при достижении конфлюентного монослоя проводят замену на среду с вирусом и инкубируют с целью адсорбции вируса с последующим сбором вируссодержащей жидкости и определением титра вируса. Штамм пригоден для накопления вируса диарен /штамм Орегон С-24/, вируса парагриппа - 3 и аденовируса /штамм В - 10/.

СОЮЗ СОВГТСКИХ

СОЦИАЛИС ГИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4664933/13 (22) 21.03.89 (46) 23.07.91. Бюл. ¹ 27 (71) Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов (72) Е.М. Петручук, Н.В. Шалунова, И,Л. Грабовская и В.Т. Ночавный (53) 578.085.23 (088.8) (56) Perkins F.Т. Jap. J. Med. Sei and Biol, 1971, 24, р. 329.

Fhllllps. С.Е. Awer Vet, Med. Assn., 1970, 157, 1964. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

ТЕСТИКУЛ ЭМБРИОНА БЫКА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСОВ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится- к области вирусологии, в частности к биотехнологии кульИзобретение относится к вирусологии, в частности к биотехнологии культуры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота.

Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота.

Для получения перевиваемой линии клеток

ТЭБ в качестве исходного материала используют тестикулы эмбриона 8 месячного возраста, полученного от здоровой коровыЯ2 1664842 А1 туры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота, Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота. Штамм получен из тестикул эмбриона, полученного от здоровой коровы путем переведения в культуру клеток, Регламент культивирования не отличается от общепринятого для культур клеток. Штамм депонирован в коллекции ВСКК(СХЖ) ¹40, Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при физиологических условиях при достижении конфлюентного монослоя проводят замену на среду с вирусом и инкубируют с целью адсорбции вируса с последующим сбором вируссодержащей жидкости и определением титра вируса. Штамм пригоден для накопления вируса диарен (штамм Орегон С-24), вируса парагриппа-3 и аденовируса (штамм В-10), донора, свободной от вирусов пневмоэнтеритов. Ткань тестикул эмбриона быка тщательно измельчают ножницами и отмывают солевым раствором Хенкса с добавлением

500 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Кусочки ткани помещают в колбу и проводят щадящую трипсинизацию

0,25%-ным раствором трипсина при 20- 2 С, Цикл noBTopRIQT 5 — 6 раз по 5 — 7 мин. Полученную взвесь клеток центрифугируют при

1000 об/мин в течение 10 мин, Осадок ресуспендируют в среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл, 1664842

55 стрептомицина. Клетки с концентрацией

500000 Kll/ìë высевают в матрасы вместимостью 1000 мл при рН 7,0-7,4. После формирования монослоя на первых -пассажах на 2 — 3 сут, а в последующих пассажах на

3 — 6 сут роста, клетки снимают со стекла

0,2о -ным раствором версема с добавлением 50 мг химопсина, подогретым до 37 2" C и пересевают в соотношении 1:2.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

В условиях термостата при 37 2 C монослойные культуры сохраняются в течение

5 — 7 дней беэ смены питательной среды при комнатной температуре 20 2 С в течение 4 сут и при 4 — 6 С 3 сут, На уровне 12 и 17 пассажа заложено на хранение в жидком азоте в сосудах Дьюара соответственно 25 и 32 ампулы, содержащие,по 2 мл суспензии клеток ТЭБ с концентрацией 4-5 10 кл/мл, Для замораживания суспензии клеток

ТЗБ применяют 5 или 107;-ное криозащитное вещество ДИСО, Для отогрева замороженные ампулы помещают в водяную баню при 37-40 С. При длительном хранении применяют жидкий азот при минус 196 С.

Для восстановления культуры, ТЗБ размораживают при 37 + 2 С, суспендируют в ростовой среде, высевают в матрасы и культивируют. в стационарных условиях. Пересев клеток производят через 5 — 7 дней, Сохранность клеток после замораживания

90-95/

Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при 37"С, рН 7,2 — 7,4, способ культивирования стационарный, среда ростовая — Игла

MEM с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, перевивка 1 раз в 5 — 7 дней, Клетки снимают со стекла

0,02О/,-ным раствором версена с добавлением на 0,5 л верссна 50 мг х мопсина. При посевной дозе 50 — 100,000 мл/мл монослой образуется на 3-4 сут без смены среды, Кратность рассева 1:2 — 1:3. Монослой состоит из эпителиоподобных полигональных или окружных клеток. Цитоплазма хорошо выражена, ядра округлой формы, хроматин расположен равномерно, Почти в каждом поле зрения выявлены митозы.

Клетки имеют четко выраженный модальный класс по числу хромосом (из 46 проаналиэированных клеток 28 содержали по 50 хромосом), Кариотип клеток содержит акроцентрические, мета- и субметацентрические хромосомы. В линии выявлено 18 различных маркерных хромосом, Наиболее постоянным для данной линии оказались 10 маркеров; M> — М, Мв, М11, Ми-Мп.

По результатам анализа иэоэнзима лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в исследуемой линии ТЭБ и в первично-трипсинизированных клетках почки эмбриона коровы (ПЭК) был сделан вывод о видовой принадлежности

ТЭБ к клеткам быка.

В перевиваемой линии ТЭБ размножаются с цитопатическим эффектом вирусы парагриппа (Пà — 3, штамм 3 КСМ), вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ, штамм

ТК-А--ВИЭВ), вирус диареи (штамм Орегон

C — 24) и аденовирусы (штамм В-10). Титры вирусов через 5 — 6 дней культивирования достигают соответственно значений

6,0 0,5 Ig ТЦД5о/мл, 6,1 +. 0,2 Ig ТЦД5о/мл

2,5 + 0,2 Ig ТЦД5о/мл и 6,1:" 0,5 Ig ТЦД5о/мл.

Штамм депонирован в коллекции

ВСКК (СХЖ) N 40, Пример 1. Культуру ТЭБ в количестве

2 -3 10 в 1 мл пересевают иэ расчета

1;2-1:3 во флаконы вместимостью 1000мл с использованием питательной среды Игла

МЕМ с добавлением 10 g, сыворотки крупного рогатого скота. Культуру инкубируют при

37 +. 2 С в термостате в течение 7 — 8 дней.

Ежедневно культуру просматривают под световым микроскопом. Через 7 — 8 дней, когда монослой клеток становится сплошным, питательную среду из флаконов сливают в сосуд для отходов, а монослой клеток промывают 3 раза солевым раствором Хенкса для удаления следов сыворотки. Вирус

ПГ-3 (шт,3 KCM) вносится в объеме 10 мл и культуру инкубируют 1 ч при 37 + 2 С для адсорбции вируса, затем добавляют 120 мл питательной среды без сыворотки. 2 флакона, вместимостью 1000 мл, оставляют для контроля незараженными. В контрольные флаконы вносят 120 мл питательной среды без сыворотки, Через 6 — 7 дней, когда в зараженной культуре появляются дегенеративные изменения в 75-907 монослоя, культуру 3 раза замораживают при минус

20 1 Ñ и оттаивают, затем вируссодержащую жидкость сливают и титруют на пробирках для определения титра вируса. Титр вируса по результатам 3-х опытов составляет 5,9 -0,5 Ig ТЦД5оумл.

Пример 2. Подготовку культуры клеток ТЗБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят вирус

ИТР (штамм ТК-А — ВИЭВ) в объеме 10 мл, Через 5 — 6 дней, когда в культуре появляются дегенеративные изменения в 50 — 75 ф, монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодержащую жидкость титруют на пробирках с культурой ТЭБ для установления титра вируса. Титр вируса по

1664842 результатам 3-х опытов составляет

6,0 0,2 ig ТЦД5о/мл.

Использование для накопления вируса крупного рогатого скота, перевиваемой линии клеток тестикул эмбриона быка (ТЭ6) по сравнению с ранее используемыми первич5 но-трипсинизированными культурами ТБ и

ПЭК, позволяет заменить дорогостоящие первично-тримеинизированные культуры

ТБ на более экономичную линию, которая характеризуется способностью легко пере10 виваться в условиях in vitro и размножаться с использованием доступных питательных сред и сывороток и может длительное время храниться беэ изменения биологических свойств в жидком азоте. В целом же переви15 ваемая линия клеток ТЭБ обеспечивает более высокое, чем культура ТБ, накопление вирусов пневмоэнтеритов крупного рогатого скота. Перевиваемая линия ТЭБ характеризуется стабильными морфологическими и

20 генетическими свойствами и простотой получения и культивирования, Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток тестикул эмбриона быка ВСКК(СХЖ) N 40, использу25 емый для накопления вирусов крупного рогатого скота, Пример 3. Подготовку культуры клеток ТЭБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят аденовиру (штамм  — 10) в объеме 10 мл. Через 5 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75 монослоя, культуру замораживают и оттаивают 3 раза, а вируссодержащую жидкость титруют на пробирках для установления титра вируса, Титр вируса по результатам 3-х опытов составляет 4,8 -0,5 ig TLN5o/ìë, fl р и м е р 4. Подготовку культуры ТЭБ и культивирование вируса проводят по примеру 1. Вирус диареи (штамм Орегон С-24) вносят в объеме 10 мл. Через 10-12 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75-90 монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодержащую жидкость титруют для установления титра вируса. Титр вируса диареи по результатам 3-х опытов составляет

2,5 ++ 0,5 Ig ТЦД50/мл.

Составитель А.Романченко

Редактор Н.Рогулич Техред М.Моргентал Корректор M.Êó÷åðÿBàÿ

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2366 Тираж 374 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5