Способ получения ронидазы

 

Изобретение относится к производству ферментного препарата ронидаза, применяемого в медицинской практике. Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и удельной активности препарата. Способ осуществляют следующим образом. Семенники крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют 0,1 н. раствором уксусной кислоты при PH 4,5 - 4,7 и 2 - 40°С в течение 2 - 4 ч в атмосфере инертного газа, экстракт отделяют и очищают сорбцией фермента в течение 1 - 2 ч на белой глине, которую берут из расчета 25 - 50 г на 1 л экстракта, и десорбцией водой при PH 4,5 - 4,7, которую берут из расчета 10 - 15 частей на 1 часть сорбента, а затем раствор сушат. Выход 7,5 - 9% от исходной массы, удельная активность 1020 - 2050 усл. ед. / 100 мг.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

О

РЕСПУБЛИН (gg)g С 12 N 9/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И 0ТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4699964/13 (22) 12.05.89 (46) 30.07.91. Бюл. У 28 (71) Всесоюзный научноисследовательский институт текстильно=галан терейной промышленности (72) Л.И.Стекольников, В.В.Рыльцев, T.Е.Игнатюк и И.И.Кутукова (53) 577.15.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 632703, кл. С 12 N 9/26, 1977.

Авторское свидетельство СССР

Р 566875, кл. С 12 N 9/26, 1976. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОНИДАЗИ (57) Изобретение относится к произ водству ферментного препарата рони даза, применяемого в медицинской

Изобретение относится к производ= ству ферментных препаратов, применяе мых в медицинской практике, а именно к способу получения ронидазы, приме няемой при лечении рубцов, контрактур и тугоподвижности суставов,при подготовке к кожнопластическим операциям по поводу рубцовых стяжений, при длительно незаживающих ранах.

Цель изобретений упрощение спо соба, повышение выхода и удельной активности препарата.

Способ заключается в том,. что после экстракции измельченных семен ников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН

4,5W, 7 и температуре 2=40 С в тейение 2 4 ч проводят очистку экстракта, Я0„, 1666534

2 практике. Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и удельной активности препарата. Спо соб осуществляют следующим образом.

Семенники крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют О, 1 н. раствором уксусной кислоты при рН

4 5W,7 и 2&0 С в течение 2W ч в атмосфере инертного газа, экстракт отделяют и очищают сорбцией фермента в течение 1 2 ч. на белой глине, которую берут из расчета 25 50 г на 1 л экстракта, и десорбцией водой при рН 4, 5=4,7, которую берут из расчета

10 15 ч. на 1 ч, сорбента, а затем раствор сушат. Выход 7 59K от ис= ходной массы, удельная активность

1020-2050 усл.ед./100 мг. обработкой последнего белой глиной в количестве 25 50 r на 1 л экстракта в течение 1-2 ч с последующим отделением осадка белой глины и об работкой его водным раствором уксус" ной кислоты при. рН 4 5&, 7 при мас совом соотношении сорбента и раство ра 1: 1О 15, а экстракцию фермента проводят в атмосфере инертного газа, Схема технологического. процесса получения ронидазы представлена в следующем виде: .

Семенники крупного рогатого скота

Измел ьч ение

Экстракция

1666534 (О 1 н. СН СООН, жидкий коэффициент

1: 1 -2р рН 4, 5 -4, 7, =2 -40 С, 2 =24 в атмосфере инертного газа)

Отделение экстракта

Очистка экстракта

Сорбция фермента на белой глине (25=50 г/л), Ф =1=2 ч, десорбция фермента раствором уксусной кислоты, рН 4,5-4 7 (10=15 ч, на 1 ч,сорбента), С=0, 51ч

1О

Сушка раствора

Выход целевого продукта составля6т 7,5 -9Х от исходной массы сырья, гиалуронидазная активность 1020

3050 усл.ед. в 100 мг.

Используемые параметры экстракцийвеличина рН раствора уксусной кис тавоты 4, 5=4, 7, температура процесса зкстракции 2&000 и время экстракции

24 ч, обеспечивают максимальное извлечение фермента. При рН ниже 4,5 йли выше 4,7 в экстракт переходят балластные белковые вещества, содержащиеся в семенниках, при температу= ре нине 2 С скорость экстракции в

О значительной степени замедляется и для се осуществления требуется уйеличивать время процесса экстракции более 4 ч, а при температуре вьш|е

40 С начинает происходить прогресси о рующая инактивация фермента„

25

35

Процесс экстракции проводят не в воздушной cpepe, a в атмосфере, ли 40 шенной кислорода, для чего через экстракционную смесь в течение всего периода экстракции пропускают инерт ный газ (азот, аргон) со скоростью

О, 2=0,4 л/ч на 1 л экстракта, по скольку именно такая скорость пропус кания инертного газа обеспечивает полное удаление кислорода. В отсутствие кислорода воздуха процессы окис ления фермента не происходят и реак-. ционноспособные группы в его молеку ле, такие, например, как остатки метионина или цистина, не подвергают ся окислению.- Тем самым в экстрак.— ционной смеси не накапливаются про-.

55 дукты окисления, не обладающие гиалу-. ронндазной активностью, отделен е которых от нативной формы фермента является затруднительным и требует введения в технологический процесс специальных методов очистки.

В этой связи процесс очистки экстракта сводится к простым приемам сорбции и десорбции, занимающим не более 3 3,5 ч на каждые 100 л экст= ракта, При этом в качестве сорбента используют белую глину, поскольку использование других известных cd бентов, например активированного угля, не позволяет полностью сорби ровать фермент и приводит к снижению выхода целевого продукта, На 1 л экстракта добавляют 25

50 г белой глины, поскольку добавле ние меньшего количества этого сорбента (менее 25 r на 1 л) не позволяет полностью сорбировать фермент не только за предусмотренный период кон такта с экстрактом (12 ч), но и за более длительный промежуток времени (4-6 ч), а добавление большего коли чества сорбента (более 50 г/л) не приводит к увеличению выхода фермен*та и потому является технологически нецелесообразным. При использовании

25 50 г белой глины на 1 л экстрах та время полной сорбции фермента составляет 1=2 ч и потому увеличение этого времени приводит к необосно ванному удлинению технологического процесса.

Для быстрой (за 0,5 1 .ч) десоРб ции фермента с поверхности сорбента используют водный раствор уксусной кислоты, имеющий рН 4 5-. 4,7, при

-этом количество раствора составляет

10 15 мас,ч. на 1 мас.ч„ сорбента.

При величинах рН ниже 4,5 или выше

4,7, а также при снижении количест венного соотношения раствора и сОр бента (менее t0 ч. раствора на 1 ч. сорбента) достичь максимального извлечения фермента не удается даже при увеличении времени контакта раствора с сорбентом (более 2 ч).

При увеличении количественного соот= ношения раствора и сорбента (более

15 ч. на 1 ч. сорбента) повышения выхода фермента не наблюдается.

Пример 1. 85 кг заморожен ных семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 85 л (жидк. коэффициент

1: 1) О, 1 н. водного раствора уксус ной кислоты, устанавливают рН 4,5, через смесь пропускают газообразный азот со коростью 0,2 л/ч на 1 л

66534

Способ получения ронидаэы, вкйк . чающий экстракцию измельченных се менников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты лри рН 4,5 4,7 и температуре 240 С в течение 2 4 ч с последующим отде лением экстракта и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения выхода и удельной актив ности препарата, экстракцию осуществ ляют в атмосфере инертного газа, а очистку проводят сорбцией экстракта белой глиной в количестве 25 -50 г на 1 л экстракта в течение 1 2 ч и десорбцией целевого продукта водным раствором уксусной кислоты при рН

4q5W,7 при массовом соотношении сорбента и раствора 1:10 15.

Составитель А.Семенов

ТехРед М.МоРгентал КоРРектоР М.Демчик

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 2498 Тираж 365 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

16 смеси и экстракцию проводят при 2 С и постоянном перемешивании в течение

2 ч, жмых отделяют сепарированием при 3000 об/мин и отбрасывают, а к

95 л экстракта добавляют 2,375 кг белой глины из расчета 25 г на 1 л ( экстракта, смесь перемешивают при

20 С 1 ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 23,75 л воды, под кисленной уксусной кислотой до рН

4,5 (из расчета 10 ч. на 1 ч. осадка) смесь перемешивают 0,5 ч, затем центрифугируют и надосадочную жйд кость сушат распыпением. Выход порош " ка 6,375 кг (7,5Х от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 1020 ед/100 мг.

Для измерения активности исполь зуют метод, основанный на предупреждении образования муцинового сгустка.

Пример 2. 85 кг заморожен ных семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 127,5 л (жидк. коэффициент

1: 1,5) 0,1 н. водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН

4,6, через смесь пропускают газооб разный аргон со скоростью 0,3 л/ч на

1 л смеси и экстракцию проводят при

21 С и постоянном перемешивании в те чение 3 ч. Жмых отделяют сепарирова нием при 3000 об/мин и отбрасывают., а к 119 л экстракта добавляют

4,462 кг белой глины (из расчета

37,5 г/л экстракта), смесь перемешивают при 21ОС в течение 1,5 ч, затем центрифугируют, к осадку добав ляют 55,77 л воды, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,6 (из расчеа 12,5 ч. на 1 ч, осадка), смесь еремешивают 45 мин, затем центрифу гируют и надосадочную жидкость сушат распылением. Выход порошка 7,01 кг

:(8,25Х от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность

1020 усл.ед./100 мг.

Пример 3. 85 кг заморожен ных семенников крупного рогатого ско та измельчают дважды на волчке, до бавляют 170 л (жндк. коэффициент

1:2) 0,1 н. водного раствора уксус ной кислоты, устанавливают рН 4,7, через смесь пропускают газообразный азот со скоростью 0,4 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 40 С и постоянном перемешивании 4 ч. Жмых отделяют сепарированием при 3000 об/

/мин и отбрасывают, а к 142,5 л экстракта добавляют 7,125 кг белой глины (из расчета 50 г/л экстракта), смесь перемешивают при 22ОС в течение 2 ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 106,8 л воды, под кисленной уксусной кислотой до рН

4,7 (из расчета 15 ч. на 1 ч. осадка), смесь перемешивают 1 ч, затем цент1 и фугируют и надосадочную жидкость сушат распыпением. Выход порошка

7,65 кг (97, от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность

2050 усл.ед./100 мг.

Формула изобретения