Способ получения полисахарида

 

Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений , в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцветий липы сердцевидной. Изобретение позволяет получить полисахарид, обладающий противогипоксической и антикоагулянтной активностью за счет того, что соцветия липы сердцевидной обрабатывают сначала 10%-ным водным раствором хлорис- - того аммония при модуле 20 и pll 5,8- 6,0 и затем 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле при модуле 50 с последующей сушкой при 35-40°С, проводят экстракцию водой при 80°С и модуле 30, выделяют целевой продукт концентрированием экстракта и обработкой двойным объемом этилового спирта при 5°С. 9 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТМНЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

At ае oD (р) С 08 В 37 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И A ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4444145/()5 (22) 18.04.88 (46) 15.l0.91. Бюл. №- 38 (7l) Курский государственный медицинский институт (72) А.И.Яковлев, П.П.1(итченко, А.А.Никулин и В.Б.((онахов (53) 547.458.88 (()88.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 861354, кл. С 08 В 37/06, 1978. (54) СПОСОБ ПОИУЧЕИИЯ П(ЯИСАХАРИДА (57) Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцветий. Изобретение относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, в частности к получению водорастворимого полисахарида из соцветий липы сердцевидной.

Цель изобретения — получение полисахарида, обладающего противогипоксической и антикоагулянтной активностью.

Пример 1. Выделение полисахарида проводят из фармакопейного растительного сырья (ГФ Х, цветки липы сердцевидной).

Очистка сырья. Для удаления сопутствующих белков цветки липы сердцевидной обрабатывают 10%-ным раствором хлористого аммония (1:20) при рН 5 ° 86 в течение 6 ч. Шрот отделяют от жидкости фильтрованием. Для удаления низкомолекулярных примесей, в том числе и неорганических, шрот обраба тывают 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле (1:50) и взбалтывают

2 липы сердцевидной. Изобретение позволяет получить полисахарид, обладающий противогипоксической и антикоагулянтной активностью за счет того, что соцветия липы сердцевидной обрабатывают сначала 10Х-ным водным раствором хлористого аммония при модуле ?0 и pll 5 86,0 и затем 5%-ным раствором диэтилового эфира в этаноле при модуле 50 с последующей сушкой при 35-400(;, проводят экстракцию водой при 80 С и модуле 30, выделяют целевой продукт концентрированием экстракта и обработ" кой двойным объемом этилового спирта при 5 С. 9 табл.

2 ч. Затем отфильтровывают. Остаток повторно обрабатывают новой порцией раствора той же концентрации. Процесс очистки проводят при комнатной температуре и энергичном перемешивании.

Остаток сушат при 35-40 С до воздушно-сухого сырья.

Экстракция. Очищенное сырье зали- вают горячей водой (1:30) при 80 (; в течение 2 ч. Затем отфильтровывают через двойной слой марли. Дополнительно фильтруют через двойной слой бумаги под вакуумом. Экстракт упаривают в вакууме над Р 0 (остаточное давление 10-15 мм рт.ст., температура

35-40 С) до 1/20 первоначального объема. Сгущенный экстракт охлаждают до о, +S (; и медленно при энергичном перемешивании прибавляют двойной объем

96%-ыого этанола, подкисленного соляной кислотой (на 1 л 96%-ного этанола

10 мл соляной кислоты). Оставляют

1684287

40 на 60 мин. Затем осадок отделяют от жидкости при центрифугировании. Промывают 60 и 96/-ннм этанолом и диспергируют в ацетоне.

Выделенный полисахарид условно назван гликуроногликан.

Выход 11,51 от веса воздушно-сухого сырья ° Зольность 1,5И. Полученный продукт может быть дополнительно очищен от белковых примесей. 1Х-ные растворы полисахарида обрабатывают смесью хлороформа и амилового спирта (в соотношении 3:1), встряхивают 25 ч.

Затем центрифугируют. Водный слой повторно обрабатывают смесью амилового спирта с хлороформом. Операции по повторяют до отрицательной реакции водного слоя с 20/-ной сульфосалициловОЙ кислотОЙ ° PRcTBop (ВОдный слОи) 20 упаривают в вакууме и выделяют полисахарид, как описано вьш е. Сушат в о„ вакууме над Р О при 35-.40 С (остаточное давление 10-15 мм рт.ст.) в течение 10 ч. Выход 95%, зольность

0,6-0,8%.

Пример 2. Биологическую активность гликуроногликана оценивают;. а) антигипоксическую активность— н трех моделях гипоксической гипоксии30 (табл. 1, 2, 3); б) антикоагулянтную активность -. по данным гемокоагулограмм (табл.4),", в) острую токсичность — по тесту летальных доз (табл.5).

Препаратом сравнения служит мукополисахарид — гепарин. В качестве контроля используют аналогичные объемы изотонического раствора хлорида натрия.

Противогипоксическую активность гликуроногликана, вводимого внутрибрюшинно белым мьш|ам массой 20+? г

Объемом, не превышающим 1,0 мл (90 опытов), оценивают по времени

45 сохранения биоэлектрической активности сердца (ЭКГ) и наличию дыхательных движений у животных.

Гипоксическую гипоксию моделируют при температуре окружающей среды (18-2100) путем: а) абтурация трахеи; б) снижение рО во вдыхаемом воздухе барокамеры; в) пребывание в гермокамере.

Абтурацию трахеи производят путем лигирования, исключая возможность

55 захвата нервных стволов лигатурой.

Время выживания животных в состоянии гипоксии (асфиксии) определяют по длительности сохранения биоэлектрической активности сердца, т.е. данным электрокардиографии (ЭКГ).

Снижение рО во вдыхаемом воздухе создают в барокамере при скорости подъема на высоту 30 м/с. Результаты опытов, оцениваемые по тесту "смертельной площадки", представлены в табл.2.

Антикоагулянтную активность гликуроногликана исследуют на б кроликах породы Ииншилла массой 2650 + 126 г при помощи серийного медицинского гемокоагулографа ГКГМ-4. Для чего раствор гликуроногликана в дозе

13,38 мг/кг и объеме 3 мл медленно вводят в краевую ванну уха кролика.

Кровь для исследования (0,1 мл) берут из второго уха животного. Гемокоагулограмму записывают через 5, 2, 24 и

48 ч после введения гликуроногликана.

В качестве контроля используют изотонический раствор натрия хлорида.

Данные гемокоагулограммы обработаны статистически и представлены в табл.4.

Острую токсичность гликуроногликана исследуют в Опытах на 7Р> белых мышах массой 20 + 2 г по тесту летальHGH дозы (JIji) при внутрибрюшинном введении в дозах 50, 100, 150, 200, 250, 500, 750 и 1000 мг/кг в объемах до 1 мл. Препаратом сравнения служил гепарин, вводимый в эквимолекулярных дозах. Контрольным животным вводили аналогичные объемы иэотонического раствора натрия хлорида. Летальность определяли через 24 ч после инъекции веществ., Результаты экспериментов представлены в табл.5.

Антигипоксическая активность гликуроногликана представлена в табл.1, 2, 3 (индексом "х" отмечены результаты, достоверно отличающиеся от контРОЛЬНЫХ, «У» — то жЕ, ОТ t ООТВеТСТВующей дозы препарата сравнения при

Р (0,05).

Антикоагулянтная активность гликуроногчтикана отражена в табл.4, Показатели, характеризующие острую токсичность гликуроногликана, представлены в табл.5.

Данные по противогипоксической и антикоагулянтной активности поли-. сахарида (А), полученного предложенным способом из соцветий липы сердцевидной и полисахариды (Б), получен5 1684?87 ного иэ соцветий липы сердцевидной по известному способу сведены в табл 5, 6, 7, 8 и 9, В табл,6-9 индексом "х" отмечены результаты, достоверно отличающиеся

5 от исходных; "у" — то же, от контроля при РС 0,05; М вЂ” среднестатические показатели; ш — среднестатические отклонения от И.

Т а б л и ц а 1

Влияние гликуроногликана и гепарина на время сохранения биоэлектрической активности сердца при абтурации трахеи у мышей (tip m) (оза, мг/кг Время сохранения био электрической активности сердца, мин

Вещество

12,38+1,0b

13,55 Е 0,20

8,40+ +1,21

9,24 0,41

7,46 + 0,25

6,69

13,38

1,65

3,30

Гликуроногликан

Гликуроногликан

Гепарин

Гепарин

Контроль

Т а б л и ц а 2

Влияние гликуроногликана и гепарина на выживаемость мышей по тесту "смертельной площадки" (И+ m) за, мг/кг Время выкивания, мин

Вещество

6,69

13,38

1,65

3,30

11,17+ 0,38

18, 28 О, 43 "

6,28+ 1,28„

6,46+ 0,19

5,43+ 0,22

Гликуроногликан

Гликуроногликан

Гепарин

Гепарин

Контроль

Формула изобретения

Способ получения полисахарида экстракцией растительного сырья с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью получения полисакарида, обладающего противогипоксической и антикоагулянтной активностью, в качестве исходного сырья используют соцветия липы сердцевидной, перед экстракцией растительное сырье дополнительно обрабатывают сначала 10Х-ным водным раствором хлористого аммония при модуле 20 и рН 5,8-6,0, а затеи

57-ным раствором диэтилового эфира в этаноле при молуле 50 с последующей сушкой при 35-40 С, экстракцию проводят водой при 80 C и модуле 30, а

15 выделение — концентрированием экстракта и обработкой двойным объемом этилового спирта при 5 С.

1684287

Т а б л и ц а 3

Влияние гликуроногликана и гепарина на выживаемость мы((ей при гипоксии в гермокамере (N » m) Доза, мг/кr Время вьокивания, мин

Бе(цество

38,45»+ 0,56

39,19+ 0,42

30,23 Ь 1,18

32,22 1,16

28,37 + 0,34

6,69

i3,38

1,65

3,30

Гликуроногликан

Гликуроногликан

Гепарин

Гепарин

Контроль

Таблица4

Влияние глнкуроногликана (а) и гепарина (б) в сравнении с контролем (в) на показатели свертываемости крови по данным гемокоагулограммы (lf+ m) Показатели

Исходные данные Динамика показателей гемокоагулограммы через

5 мин

2 ч г, с

К, с

t с

Т ф с

S, сек тпа мм

Е

П р и м е ч а н и е: г — время тромбиновой активности; К - время образования сгустка; С - константа коагуляции;

S ", константа уплотнения;Т -,константа свертывания; ma — амплитуда эластичности сгустка;

Ci — индекс коагуляции; Š— эластичность сгустка; индексом "х" отмечены результаты, достоверВо отлича(сщиеся от исходных; "у" — от контроля;

"о" - от препарата сравнения (рО (О, 05) . а) 44+ 7 б) 47< 9 в) 48+ 8

a) 105 + 11 б) 116 + 12 в) 118 (- 9 а) 325+ 18 б) 297 (. 21 в) 283+ 20 а) 548+ 37 б) 497:(. 33 в) 449+ 31 а) 493+ 22 б) 473» 24 в) 401+ 21 а) 54,0+ 4,0 б) 49,6:Ь 5,0 в) 45,7+ 0,9

a) 1 66+0,38 б) 1, 87 0, 29 в) 1, 84+0, 22 а) 75, 3+7, 8 б) 77,53:7,3 в) 79,1+5 1

62 + 16

82+ 13 )

46а 7

96 1 12

156+ 5 "

108+ 7

312+ 26

332 17

298+ 19

467+ 24

506+ 35

452Л 21

420+ 19

458 16.,2

405 18

46,0+15,,3

37,4+ 3,,4

40,3+ 2„!

1, 72+0, 31

1,25+0,24

1,72+0,3(62,0»-6,7

50, 7+8,9

67,5»7,4

77 +10 "

234+ 9

47+ 7

152 + 14

257+ 38

110 Я

339 29

353+ 38

276+ 19

553+ 33

589+ 20х

440+ 28

484+ 29

546+ 37

397(- 22

46 7(-2 5

28,7+ 2,7

43,9+ 1,8

1, 54+0, 20

1, 03+() 12

1,84 0,24

59,44 4,2

46,5+3,2

78,4+4,2

88 + 15ч k

50+ 12

48»- 6

164+ 19 "

99» 17

103+ 11

341 + 34

284+ 23

276"- 14

596+ 75

472+ 56

432+ 19

505+ 44

461+ 37

385+ 17

50,3+3,9

50, 1+4,3

45,6+2,8

f,60+0,36 i,65+0,23

1,89+0, 19

68,2+6,6

79>8+6>3

87,2+5,3

144 + 35

43 + 10

45+ 8

161 + 19

108+ 16

120 »+ 8

252+ 24

271 1 24

297+ 16

553+ 27

485+ +43

469+ 28

394+ 55

450+ 36

419 3 25

50,5» 2;7

52,31 4,5

42,1+ 3,3

1,48+(), 68

1,83Й(), бб

1,68 0,39

65,1 -6,2

89, 2+8,4

1684287

Таблица 5

Острая токсичность гликуроногликяна и гепарина при внутрибрюшинном введении белым мышам (4+ ш) Вещество Показатель летальности, мг/кг

I Т 6 84

Гликуроногликан На г Нет Нет

Гепарин 122,3(74,5 + 170,2) 54,3 190,3

Т а б л и д а 6

Влияние полисахаридов А и Б на время сохранения биоэлектрической активности сердца при абтрубации трахеи у мышей (М +ш) Доза, мг/кг Время сохранения биоэлектрической активности сердца, мин

Вещество

Таблица 7

Влияние полисахаридов А и Б на выживаемость мышей по тесту "смертельной площадки" (И1 m) Доза, мг/кг

Время выживания, мин

Вещество

Т а б л и ц а 8

Влияние полисахаридов А и Б на выживаемость мышей при гипоксии в гермокамере (М+ m) Вещество Доза, мг/кг Время выживания, мин

А

А

Б

Б

Контроль

А

А

Б

Б

Контроль

А

А

Б

Б

Контроль

6,69

13, 38

6,69

13, 38

6,69

13,38

6,69

13,38

6,69

13, 38

6,69

-13,38

12,33 + 1,06

13э55 + +Оэ20

8,23 «+ +1,20

10,07 + 1,26

7,46 + 0,25

11, 17+ О, 38

18,28+ 0,43

6,87+ 0,41"

8) 12+ 0,44.

5,434- 0,22

38,45 «+ 0,56

39, 19 t 0,42

32,28 1,31 "

33,30 . (2,09

28,37 + 0,34

168428 i

Таблица 9

Влияние полисахаридов Л и Б в сравнении с контролем В на показатели. свертываемости крови по данным гемокоагулограммы (М+ m) Показатели

Исходные данные Динамика показателей гемокоагулограммы через, ч

2 24 48 с

К, с с

Т, с

S, с

П р и м е ч а н. и е: e — время тромбиновой активности; К вЂ” время образования сгустка; t — - константа коагуля-ции; Т вЂ” константа свертывания; $ — константа уплотнения; ma — амплитуда эластичности сгустка; Ci. — индекс коагуляции; E — эластичность сгустка, г

Составитель Т.Мартинская

Редактор М.Келемеш Техред N.Äèäüïñ Корректор М.Шароши

Заказ 3483 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям.и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

А) 44+ 7

Б) 45+ 5

В) 48+8.

А) 105+ 11 Б) 112+ 8

В) 118+ 9

А) 3251 18

Б) 291+ 15

В) 283»+ 20

А) 548+ 37

Б) 453+ 28

В) 4494.- 31

А) 493 - 22

Б) 422+ 17

В) 401+ 21

А) 540= 4,0

Б) 48,3+ 1,6

В) 45,7 5 0,9

А) 1,66 + 0,38

Б) 1,73+0,27

В) 1, 84»+О,, 22

А) 75 ь 3: :7,89

Б) 68,816,,14

В) 79, 13»+5, 12

6?+ 16

45+ +9

46+ 7

95 g12

1202 9. 108+ 7

312 + 26

318 - 12

298+ 17

467+ 24

4674. 22

432+ 21

420+ 19

418"= 16

405+ 18

46,0+15,3

46,9+4,3

40,3+2, 1

1,54+0,28

1, 71 0,21

1 j,72+0,3 !

62,0+6,7

65,2+6,2

67,5+7,4

77+ 10ЧО

52»+ 4

47+ 7

152+14

1202 6

110+ 8

3394 29

322+ 1 7

281+19

552+32, 9

491»+ 18

440+28

4841.29

426 .1 0

397 22

46, 7 2, 4

47, 5+3

43, 9 -1, 8

1,54+0, 20

1, 68+0, 19

i,84»+0,24

59 4+4 2х

67,3+5,7

78,4 .4,2

88+ 15

52+ 4

48+ 6

164+19 "

118+ 3

103+ 1 1

341 34

315 +15

276+ 14

596+ +75

487+ 12

432+ 19

505+ 44

452+ 13

385+ 17

50,3+3,9

49, 8+5, 2

45,6+2,8

1,744-0 12

1, 89+0, 19

68,2+6,7

68,9 :8, 1

87, 2»+5, 3

144+ 35

56+ 6

45+ 8

161+ 19

105" 9

120< 8

252 24

289+ 11

297 - 16

553+?7

446+ 24

469+ 28

394+ 55

405+ 18

419+ 25

50,5+2,7

45,3+4, 1

42, 1+3,3

1,48+ 0,68

1, 70+0, 25

1,68+0,39

65,1+6,2

66,3+7,6

89,2 8,4