Способ получения производных гепарина, обладающих атромбогенным действием
Изобретение относится к способам получения новых производных гепарина, обладающих атромбогенным действием, которые могут быть использованы в медицине для получения атромбогенных поверхностей. Изобретение позволяет упростить способ и получить возможность иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании полученных соединений. Это достигается за счет того, что гепарин обрабатывают 20 - 100-кратным молярным избытком янтарного ангидрида в 0,1 М водном растворе тетрабората натрия, диализуют против дистиллированной воды с последующей лиофилизацией. Выделенный сухой продукт растворяют в безводном диметилформамиде и полученный раствор обрабатывают N-оксисукцинимидом и дициклогексилкарбодиимидом в молярном соотношении 1:1, причем количество каждого компонента составляет 1 - 10 молей на 1 моль гепарина, реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре, выделяют дициклогексилмочевину при охлаждении раствора, а целевой продукт осаждают этилацетатом из фильтрата. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
" " ×ÞÎÈ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4694703/05 (22) 18.05,89 (46) 15.08.91,Бюл,М 30 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) М.Д.Смирнов, А.В.Мазуров, 3.А.Габбасов, Е,Г.Попов и Г,П.Самохин (53) 547.458,5(088.8) (56) 1.ondon J.N. et ets. Catalltlc activity and
platelet vactlvlty of heparin covalently bonded
to surfaces, — J, СНп, Med. 1985, ч.105, р. р,219-226. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕПАРИНА, ОБЛАДАЮЩИХ АТРОМБОГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к способам получения новых производных гепарина, обладающих атромбогенным действием, которые могут быть использованы в медицине для получения атромбогенных поверхностей. Изобретение позволяет упростить
Изобретение относится к способу получения новых производных гепарина, обладающих атромбогенным действием, которые можно использовать в медицине для получения атромбогенных поверхностей.
Цель изобретения — упрощение способа и возможность иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании целевого продукта.
Пример 1. Получение N-оксисукцинимидного эфира гепарина (ОЭГ-1), содержащего 1 активированную группу на 1 молекулу гепарина.. Ж 1669919 А1 (ч)5 С 08 В 37/10. А 61 К 31/725 способ и получить возможность иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании полученных соединений, Это достигается за счет того, что гепарин обрабатывают 20-100кратным молярным избытком янтарного ангидрида в 0,1 М водном растворе тетрабората натрия, диализуют против дистиллированной воды с последующей лиофилизацией. Выделенный сухой продукт растворяют в безводном диметилформамиде и полученный раствор обрабатывают
N-оксисукцинимидом и дициклогексилкарбодиимидом в молярном соотношении 1:1, причем количество каждого компонента составляет 1-10 моль на 1 моль гепарина, реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре, выделяют дициклогексилмочевину при охлаждении раствора, а целевой продукт осаждают зтилацетатом из фильтрата, 1 табл.
Получение "гидрофобизованного" гепарина, 500 мг гепарина (средняя мол. масса
15000 дальтон) растворяют в 30 мл 0,1 М тетрабората натрия, рН 9,2, добавляют 1 г янтарного ангидрида при перемешивании.
Уменьшение рН компенсируют внесением
10 M NaOM под контролем рН-метра. Оставляют стоять 1 ч, диализуют 3 раза против 3 л дист. воды в течение 12 ч, 3 раза против 1 л 20 мМ триэтиламина в течение суток, лиофилизуют, хранят на -20 С, Выход 500 мг
"гидрофобизованного" гепарина.
Этерификация. 45 мг "гидрофобизованного" гепарина вносят в 1,2 мл ДМФА, добавляют 20 мг N-оксисукцинимида и 26 мг
1669919 дициклогексилкарбодиимида и оставляют стоять на сутки при 20ОС. Раствор охлаждают до -20 С, фильтруют. К фильтрату добавляют 15 мл этилацетата, высушиваюг нл воздухе, хра««ят при-20"С. Выход 50 мг(80 5 от теоретического), Продукт содержит 1 моль сукцинимидных групп нл 1 моль гепарина (см. пример 4), хорошо растворим в диметилформамиде (ДМФА), диметилсульфоксиде (ДМСО) и воде, не растворим в на- 10 полярных органических растворителях.
После полного «идролиза в воде (1 ч, 20 С.
0,15 М хлористого натрия, рН 7,4) образуется раствор геплринл, имеющий 80 лнлгикоагуляцион ной активности исходного 15 гепарина, П р и м а р 2. Полу «а««иа ОЭГ-2, содержащего 5 лктиниро,лнных групп ««а молекулу гепаринл, Осущаствля«ог аналогично примеру 20
1, за исключением то. о, что на 45 Ml "гидрофобизова««ного" геплрина берут 100 мг
N-оксисукцинимида и 130 «.«г дициклога«;— силкарбодиимида. Выход 78 мг (63% от Теоретического). Свойс«нл продукта тлкие,ке 25 как в примере 1. за исключением того, ITQ на 1 моль геплрина приходится 5 моль сукцинимидных групп, П р и M е р 3. Получение ОЭГ -10, содержащего 10 лктивировлнных групп на 1 Мопе- 30 кулу гепаринл.
Осу щест«Зля ют лналогич«10 п р«1 меру
1, за исклю «анием того, что ««л 4.; м« "гидрофобизовлнного" гег«арина берут 200 «1«
N-оксисукцинимида и 260 мг дицикло«ек- 35 силкарбодиимидл. Вь«лод 100 мг (44 -l, от теоретического). Свойства продукга лкие же как в примере 1, за «1скл«оче««ием «ого, что на 1 моль гепарина приходи гся 10 моль сукцинимидных групп, :10
Пример 4. Определение коли,ествл
N-оксисукцинимидных групп н ОЭГ-1, ОЭГ5 и ОЭГ-10.
В кювету спектрофотометра вносят 3 45 мл 0,1 Мтетрабор,ата натрия, рН 9,2, Ä1
10 мкл раствора (30 мг/мл) ОЭГ-1 или
ОЭГ-5, или ОЭГ-10 в ДМФА и фиксируют изменение оптической плотносiu при длине нолнь! 260 нм. Коэффициент 50 экстинкции выделяющегося N-оксисукци«1имида равен 8400 1/моль. Для ОЭГ-1 прирост оптической плотности равен 0,12 для ОЭГ-5 0,64, для ОЭГ-10 1,23 ед. оптической плотности, Это соответствует 1,5 и 55
10 моль N-оксисукцинимидных груп««на 1 моль гепарина (средняя молекулярная масса око lo 15000 дальтон).
Пример 5. Определение атромбогенных свойств ОЭГ-1, ОЭГ-5 и ОЭГ-10.
5.1, Подготовка тромбогенной поверхности, В лунки полистироловой плашки ("Мультивел", диаметр лунок 16 мм, обьем лунок 2 мл) заливают по 0,5 мл раствора коллагена человека типа 1 (10 мкг/мл 0,1" M хлористого натрия) и инкубируют ночь при 20ОC. Лунки отмывают физиологическим раствором (ФР) (0,15 М хлористо о натрия, рН 7,5) и вносят в них по 200 мкл ФР, 5.2. Обработка поверхности эфирами гепарина (ОЭГ).
Б лунки, подготовлен««ые по 5.1, вносят по 10 мкл растворов ОЭГ-1 или ОЭГ-5, или
ОЭГ-10, 30 мг/мл ДМСО, инкубируют10 мин при 37 С, промывают 10 раз по 2 мл ФР. В качестве контрольной поверхности используют анллогичные белковые поверхности, обработанные оаствором обычного, немодифициронлнного гепарина (1 мг/мл в течение 10 мин при 37 С и затем также отмытые
ФР. Для сравнения свойств предлагаемых веществ с известным способом используют колллганоную поверхность, нл которой гепарин иммобилизонлн в соотнетстнии с изнестнь«м методом, по трехступенчатой методи êp.
Зависимость эффективности I1MMQ билизлции N îêñèñóêöèíèìèäíûõ эфиров геплрина на поверхности, покрытой сывороточным альбумином человека, от параметров способа представлена ниже;
Отношение количе- «, ства молей янтарноfo л«««идридл к количеству молей !
« гепарина
«
150 рН н ходе обработки янтарнь м ангидридом 7,0
7,5
8,0
10,0
11,0
12,0
Отношение количества моль N-оксисукцинимида к количеству моль гепарина в ходе этерификации
Эффективность им- мобилизации, /
5
7
Эффективность иммобилизации, %
5
7 б
Эффективность иммобилизации.
1669919
5.3.Измерение задержки тромбинового времени.
Б лунки, обработанные ОЭГ, и контрольные вносят по 0,2 мл цитратной плазмы человека и по 0,1 ед. тромбина в растворе бычьего сывороточного альбумина 1 мг/мл
ФР, инкубируют при 37 С и измеряют время образования сгустка. Для контрольных лунок оно составляет 3,0+0,5 мин (n=5), а для лунок, обработанных любым из трех ОЭГ, 8,0+2,0 мин (n=5). Таким образом, обработка тромбогенной поверхности ОЭГ замедляет время образования сгустка в 2-3 раза по сравнению с контрольной поверхностью.
Для известного способа эта характеристика не приведена, 5.4. Измерение адгезии тромбоцитов.
Тромбоциты человека получают центрифугированиемиз донорской крови, взятой в кислый цитратный антикоагулянт. Клетки инкубируют с 51-Сг-хроматом натрия 30 мин при 37 С и отделяют от несвязавшейся радиоактивной метки гельфильтрацией через Sepharose 4В (Farmacia, Швеция). В результате, 0,2 мл суспензии тромбоцитов (100 млн/мл) имеют радиоактивность 60000 имп/мин, В контрольные, обработанные ОЭГ и геларином по известному методу лунки (см.5,2) вносят по 1 мл цитратной плазмы и инкубируют 60 мин при 37 С, затем плазму сливают и в лунки вносят по 200 мкл цитратной плазмы и по 200 мкл описанной выше суспенэии тромбоцитов. Лунки инкубируют, плавно покачивая 1 ч при 37ОС, отмывают 4 раза по 1 мл ФР и просчитывают связавшуюся с ними радиоактивность, По связавшейся радиоактивности определяют количество
45 адгеэированных на поверхности тромбоцитов. В контрольных лунках связывается
8,0+1,0 внесенных тромбоцитов, в лунках. обработанных ОЭГ-1 2,3+1,5о . ОЭГ-5
2,4+1,3, ОЭГ-10 2,6+1.2% (п=3). В лунках, обработанных в соответствии с известным методом 3, 1+1, 1 (и =5).
Видно, что адгезия тромбоцитов после обработки тромбогенной поверхности ОЭГ уменьшается в 2-4 раза по сравнению с контрольной поверхностью и достоверно не отличается от адгезии на поверхности, полученной в соответствии с соединением известного способа.
Обработка тромбогенной поверхности полученными эфирами гепарина вызывает задержку тромбинового времени и снижение адгезии тромбоци оь.
Предлагаемые N-оксисукцинимидные эфиры гепарина — бе1ые аморфные вещества, растворимые в воде, ДМФА, ДМСО, гигроскопичны. Они обладают оригинальными свойствами: способны быстро реагировать с аминогруппами тромбогенной поверхности, а в случае гидролиза образуется исходный гепарин, имеющий практически неизмененную актикоагулянтную активность. Как при гидролизе, так и в случае присоединения эфиров гепарина к поверхности не выделяется никаких токсичных продуктов. Последнее обстоятельство важно, так как позволяет использовать предлагаемые продукты для элементов аппаратов, имеющих непосредственныи контакт с кровью, не извлекая их из организма больного. При этом часть эфиров гепарина присоединяется и обеспечивает кратковременное антикоагулянтное действие.
В изьестном способе химическая иммобилизация гепарина сложна, многостадийна, требует больших количеств дорогостоящегоо водорастворимого карбодиимида.
Иммобилизацию гепарина нельзя проводить не извлекая протез из организма больного.
Производные гепарина пригодны и для обработки поверхностей in vitro. В отличие от ранее известных поедлагаемые вещества позволяют существенно удешевить, упростить и ускорить процесс иммобилизации гепарина, так как вместо трех длительных и трудоемкиx стадий с использованиеM дорогих и ядовитых веществ иммобилиэацию можно провести в одну стадию в физиологических условиях, При этом ие используется и не выделяется токсических веществ, отпадает иеобходимос-:ь отделять продукть: побочных реакций.
Формула изобретения
1669919
Редактор М.Киштулинец Техред М.Моргентал Корректор О.Кравчук
Заказ 2714 Тираж 313 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035. Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Способ получения производных геперина, обладающих атромбогенным действием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и возможности иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании целевого продукта, гепарин обрабатывают 20-100-кратным молярным избытком янтарного ангидрида в О,l
М водном растворе тетрабората натрия, диалиэуют против дистиллированной воды с последующей лиофилизацией, выделенный сухой продукт растворяют в безводном диметилформамиде и полученный раствор обрабатывают N-оксисукцинимидом и дициклогексилкарбодиимидом в молярном
5 соотношении 1:1, причем количество каждого компонента составляет 1-10 моль на 1 моль гепарина, реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре. выделяютдициклогексилмочевину при охлаждении
10 раствора, а целевой продукт осаждают этилацетатом из фильтрата,
