Способ выделения днк-полимеразы tru из биомассы бактерий микроорганизма jнеrмus ruвеr вкм 1258

Авторы патента:

C12R1 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии. Цель изобретения-упрощение процесса, увеличение удепьной активности и выхода фермента. Способ заключается в получении биомассы Thermus ruber BKM 1258, разрушении клеток ультразвуком, отделении дебриса ультрацентрифугированием, фракционировании сульфатом аммония в интервале 35-75% насыщения и колоночной хроматографии, осуществляемой последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепарин-сефарозе в линейном градиенте NaCI 0-0,8 моль. Степень очистки ДНК-полимеразыТги 11800 раз, выход по активности 66,6%, удельная активность 22000 ед/мг белка.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4605487/13 (22) 22.11.88 (46) 23.12.91. Бюл. ¹ 47 (76) А.С, Каледин (53) 577.15.08155.2(088.8) (56) Каледин А. С., Слюсарен ко А. Г., Городецкий С. И. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus ruber. вЂ” Биохимия, т. 47, вып. 11, с. 1785 вЂ” 1791, 1982. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Tru ИЗ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ МИКРООРГАНИЗМА THERMUS RVBER BKM

1258

Изобретение относится к молекулярной биологии, касается выделения фермента

ДНК-полимеразы и может быть использовано в генной инженерии, Цель изобретения вЂ” упрощение процесса, увеличение удельной активности и выхода фермента, Способ заключается в культивировании штамма бактерий рода Thermus ruber BKM

1258 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы при 55 вЂ” 70 С с последующим выделением и очисткой целевого фермента колоночной хроматографией при линейном градиенте 0-0,8 M NaCI последовательно на

KM-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепаринсефарозе, Пример, Для осуществления роста культуры Thermus ruber B KM 1258 подготавливают питательную среду, содержащую в 1.,!Ы 1701112 Аэ (я)я С 12 N 9/12//(С 12 N 9/12, С 12 R 1/100) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии. Цель изобретения вЂ” упрощение процесса, увеличение удельной активности и вь:хода фермента. Способ заключается в получении биомассы Thermus ruber ВКМ

1258, разрушении клеток ультразвуком, отделении дебриса ультрацентрифугированием, фракционировании сульфатом аммония в интервале 35 вЂ” 75% насыщения и колоночной хроматографии, осуществляемой последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепарин-сефарозе в линейном градиенте NaCI

0 вЂ” 0,8 моль. Степень очистки ДНК-полимеразы Tru I 1800 раэ, выход по активности 66,6%, удельная BKTYiBHocTb 22000 ед/мг белка.

°° л; 200 г картофельного отвара, 5 г пептона и

1 г дрожжевого экстракта, остальное водопроводная вода (рН среды 8,0). Рост произ- д водят при 60 С в качалочных колбах обьемом 2 л, 120 вЂ” 150 об/мин в течение 16 ч до поздней логарифмической фазы. Клетки собирают центрифугированием при 4000

Д об/мин с 6000 g в течение 10 мин с 1 л среды

7 г биомассы. Суспендируют в буфере ЕВ следующего состава: 10 мМ трис-HCI, рН

7,5, 5 мМ 2-меркаптоэтанол. 0,5 мМ ЭДТА, 0,4 М NaCI, 25 мкг/мл РМЯГ (фенилметилсульфонилфторид}. Разрушают клетки ульт- ) развуком (22 кГц 10 раз по 1 мин, мощность тока 100 мА).

Центрифугируют при 40000 об/мин 1,5 ч с 105000 g, Супернатант разбавляют в два раза 10 мМ трис-HCI рН 7,5 и осаждают белок (ИН4)рЯО в интервале 35-75% насыщения за 30 мин при t = 4 С, центрифугируют 20 мин 15000 o6/мин с 20000 g. Осадок

1701112

Составитель B. Варламов

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор M. Максимишинец

Редактор О. Головач

Заказ 4480 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР l13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 растворяют в буфере А, содержащем 10 мМ

К-фосфата рН?,5, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, диализуют против этого же буфера (12 ч) и наносят на колонку с КМ (карбоксиметил)-Тоеперлом. 5

Элюируют буфером А. Белок, не связавшийся с сорбентом, собирают при помощи спектрофотометра при длине волны 280 нм.

Эту фракцию диализуют против буфера

В. содержащего 10 мМ трис-HCI рН 7,5; 0,5 10 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, и наносят на колонку с ДЭАЭ-Тоеперлом 650 моль.

Элюируют 0-0,6 моля KCI (линейный градиент), Тестирование ДНК-полимеразной активности выделенного фермента на 15 матрицах ДНК-типа проводят в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей: 25 мМ трисHCl рН 9,0, 15 мМ KCI, 5 мМ MgClz, 1 мМ

2-меркаптоэтанола, 10 нмоль d NTP (1 мк Ки (Н1 dGTP) и 140 мкгlмл активированной 20

ДНК. Тестирование проводят при 70 С в течение 30 мин.

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует включение 10 нмоля 25 и редшественников в кислотонерастворимый продукт на 30 мин в стандартных ус»овиях инкубации.

Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диалиэуют 30 против буфера В на колонку с гепарин-сафарозой 4В, Злюируют линейным градиентом

0 вЂ” 0,8 NaCI.

Фракции тестируют так же, как и после колонки с ДЭАЭ-Тоеперлом. Активные 35 фракции объединяют и диализуют против буфера С, содержащего 10 мМ Трис-HO pH

7;5, 100 мМ KCI, 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЗДТА, 50% глицерина, до концентрации 1 ед.акт/мкл, и хранят при 20ОС. 40

Полученный фермент ДНК-полимеразы

Tru и имеет следующую характеристику: молекулярная масса 70000 дальтон (+1,5 ); рН оптимум 9,0 + 1,0; рН стабильность 7,5-12,0 (при рН 6,5 активность менее 5/ от максимальной).

Ингибиторы фермента: полиамины (спермин-20 мМ, спермидин 100 мМ, алкалоид кураре 20, фторид натрия NaF 50 мМ)

Фермент проявляет резистентность к

ЯН-реагeнтaм.

Температурный режим 50-80 С. Температурный оптимум 68 вЂ” 70 С. Термостабильность: 90 исходной активности после двухчасовой преинкубации при 70ОС, Оптимум моновалентных катионов: Ка и К 0,015 М.

Оптимум дивалентных катионов: Mg и

Мп и 0 15 мМ соответственно.

Изоэлектрическая точка: 8,2 + 0,1 (изоэлектрофокусировка).

Константа Михаэлиса: для dNTP 63 мкМ, Фермент не содержит эндо- и экзонуклеазных активностей.

Степень очистки ДНК-полимеразы Tru составляет I180 раз, выход по активности

66,6%, а получаемая удельная активность

22000 ед акт/мг белка, Формула изобретения

Способ выделения ДНК-полимеразы

Тш из биомассы бактерий микроорганизмов Thermus ruber BKM 1258, предусматривающий разрушение клеток ультразвуком, отделение дебриса ультрацентрифугированием, фракционирование сульфатом аммония в интервале 35 вЂ” 75 насыщения и колоночну1о хроматографию в линейном градиенте Na CI 0-0,8 моль, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения удельной активности и выхода фермента, колоночную хроматографию осуществляют последовательно íà KM-Тоеперле, ДЭАЗ-Тоеперле и гепарин-сефарозе,

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению индуктора устойчивости корнеплодов сахарной свеклы путем экстракции мицелия гриба Botrytis cinerea

Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1 // 1698286

Способ консервирования рекомбинантного штамма рsеudомоnаs species продуцента @ -2 интерферона // 1698285

Способ получения ароматического продукта с запахом розы // 1698276

Изобретение относится к эфиромасличной промышленности, в частности к способам получения ароматического продукта с запахом розы

Способ приготовления закваски для получения кисломолочного продукта // 1697684

Изобретение относится к молочной про- -мышленности и может быть использовано при приготовлении заквасок для получения диетических кисломолочных продуктов

Способ получения ноурзеотрицина // 1694642

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частносы к производству антибиотиков Штамм Streptomyces noursei 33700, ZIMbT 43701 или ZIMET 43708 культивируют в ферментационной среде, которая в качестве источника углевода содержит кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничную муку, в глубинных аэробных условиях при 28 - 32°С

Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (над) // 1693057

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД)

Питательная среда для культивирования micrococcus luтеus вкпм в-2836 - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы mlu1 // 1693041

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения сайт-специфической эндонуклеазы Mlu I, С целью повышения выхода биомассы и фермента продуцента сайт-специфической эндонуклеазы Mlu I - Micrococcus luteus ВКПМ В- 2836 культивируют на среде, содержащей следующие компоненты, мас.%: гидролизат казеина 1,8-2,0; дрожжевой экстракт 2,7-3,0; хлористый натрий 0,2-0,3; дистиллированная вода остальное

Способ непрерывного культивирования засевных дрожжей при производстве спирта и хлебопекарных дрожжей // 1693040

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способам непрерывного культивирования засевных дрожжей в двухпродуктовом производстве спирта и хлебопекарных дрожжей из мелассы

Способ производства крепленого вина // 1693030

Изобретение относится к винодельческой промышленности, в частности к способам производства крепленых вин

Способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro // 2101351

Штамм rhodococcus species 56д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов // 2101352

Изобретение относится к микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, пригодного для очистки почвы, пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов в течение 7-14 суток, в широком диапазоне температур 12-30oC

Способ отбора иммуногенных штаммов и субкультур живых сибиреязвенных вакцин // 2101355

Изобретение относится к медицинской микробиологии и иммунологии, в частности, к разработке, производству и контролю качества живых сибиреязвенных вакцин

Способ индикации бактериальных антигенов // 2101356

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для экспрессной индикации бактериальных средств при возникновении чрезвычайных ситуаций

Штамм гриба claviceps purpurea tul. - продуцент эргокристина // 2102470

Штамм lactobacillus plantarum 435, используемый при производстве мясопродуктов // 2102473

Штамм бактерий pseudomonas species, используемый для утилизации формальдегида и способный при этом потреблять формальдегид в качестве единственного источника углерода и энергии в бедной минеральной среде // 2102474

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, используемых для биологической утилизации формальдегида, а также сопутствующих ему метанола и формиата в сточных водах химических производств (нефтехимзаводы, производства карбамидных смол, пластмасс и т.д.)

Штамм бактерий bacillus stearothermophilus кк-вкм в-2130d, используемый для бактериологического контроля эффективности паровой стерилизации // 2102475

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующего микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского и ветеринарного назначения термическим методом, а именно стерилизации водяным паром

Способ моделирования лепрозной инфекции // 2102482

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для моделирования лепрозной инфекции на лабораторных животных

Комбинированная питательная среда для дифференциации mycobacterium tuberculosis и mycobacterium bovis // 2102483