Штамм бактерий neisseria меningiтidis серогруппы в - продуцент капсульного полисахарида и полисахаридно- белкового комплекса

 

Изобретение относится к биотехноло- '"ии и касается получения нового штамма бактерий Neisserla meningitidfs-продуцента капсульного В-полисахарида и полисаха-' ридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингококковых препаратов. Целью изобретения явлйвтся получение штамма бактерий N.meningitidls серогруппы В № 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича), активно продуцирующего В-полисахарид. Выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к полисахаридно-ббелковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахариднобелковому комплексу известного штамма. 3 табл.Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Neisserla menlngltldis - продуцента капсульного! В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингококковых препаратов.Большинство диких штаммов менингококка серогруппы В продуцирует группоспецифический капсульный полисахарид (В-полисахарид)-сиаловую кислоту в незначительных количествах, что не позволяет использовать эти штаммы в качествепродуцентов В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса.Известны штаммы бактерий Neisserla meningltidls серогруппы В - продуценты капсульного полисахарида.Недостатком этих штаммов является небольшой выход В-полисахарида, что выражается в низком уровне антител к В-полисахариду у мышей, иммунизированных 10 мкг полисахаридно-белкового антигена внутрибрюшинно.Цель изобретения - получение штамма бактерий Neisserla menlngltidis серогруппы В NS 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасеви-XIО 0000Ь. о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4762342/13 (22) 22,11.89 (46) 30.01.92. Бюл. М 4 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.M.Må÷íèêîâà, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (72) И.А. Баснакьян, Н.Н.Алексахина, В.И.Карабак, Т.А,Артемьева, В.M.Боровкова, Л.Н.Решилов, В.И.КУвакина, А.П.Аллилуев, О.В.Котельникова и И.И.Валериус (53) 663.15(088,8) (56) Gotschlich Е.С., Giu Т.Х., Artenstein М.S.

J. Exp. Med., 1969, v.129. р. 1349-1365.

Moreno C„GifeIy МЯ., Езда!!е !. Infect.

and !тввп„1985, v.47, р. 527 — 533. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ NEISSERIA

MENING!TIDIS СЕРОГРУППЫ В вЂ” ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА И

ПОЛИСАХАРИДНО-БЕЛКОВОГО .КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Nelsserla meningltldls — продуцента капсульного В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингококковых препаратов.

Большинство диких штаммов менингококка серогруппы В продуцирует группос- . пецифический капсульный полисахарид (В-полисахарид)-сиаловую кислоту в незначительных количествах, что не позволяет использовать эти штаммы в качестве

nm5Uдо 1 708846 А1 (Я)5 С 12 N 15/01, С 12 Р 19/04 (57) Изобретение относится к биотехноло-.ии и касается получения нового штамма бактерий йе!ззег!а meningltidis — продуцента капсульного В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингококковых препаратов. Целью изобретения является получение штамма бактерий

К.meningltidls серогруппы В N. 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича), активно продуцирующего В-полисахарид. Выход наиболее крупных молекул В-поиисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к полисахаридно-ббелковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахариднобелковому комплексу известного штамма.

3 табл.

00 продуцентов В-полисахарида и полисаха- рр ридно-белкового комплекса.

Известны штаммы бактерий !че!ззег!а

menlngltldis серогруппы  — продуценты О" капсульного полисахарида.

Недостатком этих штаммов является небольшой выход В-полисахарида, что выражается в низком уровне антител к В-полисахариду у мышей, иммунизированных

10 мкг полисахаридно-белкового антигена внутрибрюшинно.

Цель изобретения — получение штамма бактерий Nelsseria meningltldis серогруппы

В N. 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасеви1708846 ча), активно продуцирующего В-полисахарид.

Штамм получен путем селекции из музейного штамма N.menlngittdis ВС-5, хранящегося также в коллекции ГИСК им, Л.А.Тарасевича, Для этого из отдельно выросших на чашKGx Петри с 20 -ным сывороточным агаром

Хоттингера колоний отбирали колонии в Я-форме. При изучении их в косопроводящем свете и с использованием бинокулярной лупы колонии должны быть яркие радужные с переходом цвета от оранжевого в зелено-голубой с узким оранжевым или зеленым наружным краем.

В том случае. когда колонии отвечают описанным требованиям, проводят второй пассаж, Для этого типичные колонии в $форме (по одной) пересевают в пробирки.со скошенным сывороточным агаром Хоттиненгера и инкубируют при+37 С в течение

18-20 ч. Проверяют чистоту и морфологию выросших культур в мазках, окрашенных по

Грамму в модификации Калины, а также путем посева культур в среды Гисса, серологические свойства — в реакции аггпютинации на стекле с гомологичными и гетерологичными агглютинирующими менингококковыми сыворотками.

Отобранный ш амм, типичный по всем показателям, смывают с косяка сахарозо-желатиновой средой и лиофильно высушивают. Штамм хранят в лиофильновысушенном ",îñòîëíèë с сахарозо-желатиновым стабилизатором в ампулах в холодильнике при +4-6 С.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки. Мелкие грамотрицательные парные или одиночные кокки одинакового размера.

При изучении под электронным микроскопом отмечены закономерные изменения ультраструктуры клеток в процессе периодического культивирования в ферментере.

В экспоненциальной фазе клетки имеют сохранную ультраструктуру, в том числе полисахариднуа микрокапсулу, представляющую собой мелковетвистый гранулярный компонент, определяемый ультрацитохимической реакцией с рутениевым красным, B фазе максимальной концентрации появляются лизированные особи, в большинстве клеток происходят деструктивные изменения, При визуальном изучении выросших колоний на плотной среде (1,5 агара Хоттингера с 20>(сыворотки крупного рогатого скота; рост в атмосфере СО в термостате при 37 С) и при использовании бинокуляр15

20 ной лупы в естественном освещении колонии в S-форме не более 2 мм в диаметре, прозрачные с голубоватым оттенком, ровными краями и голубоватой поверхностью.

5 При изучении колоний в косопроходящем свете (угол наклона светового луча 30 ) с использованием бинокулярной лупы колонии обладают ярко-оранжевым свечением.

Рост штамма возможен на следующих

10 питательных средах: А. Среда Коан-Веллер в модицикации Э.К.Фаньковской, г/л:

Кислотный гидролизат казвина 18 — 22

Крахмал растворимый 0,5-1,0

Однозамещенный фосфат калия 0,3 — 0,6

Хлорид магния 0,2-0,5

Сульфат меди 0,0005-0,002

Глутаминовая кислота 0,5 — 1,0

Цистеин . 0,02 — 0,05

Диализат дрожжей 80-100 мл рН среды 6,6-6,8

Б. Синтетическая среда, г/л:

Хлорид калия 0,08 — 0,010

25 Хлорид натрия 5 — Y

Хлорид аммония 1,24 — 1,26

Водный сульфат магния 0.05 — 0,07

Двузамещенный

30 фосфат.натрия 2,3-2,7

Цитрат натрия 0,4-0,6

L-Моноглутамат натрия 1,2-1,4 (:цистеин гидрохлорид 0,02-0,04

35 Сульфат железа 0,001 рН среды 7,2 — 7,4 устанавливают с помощью

1N HCI. Непосредственно перед употреблением добавляют 40 /-ный раствор глюкозы из расчета 1,5-1,6 г/л среды.

40 Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: при выращивании на среде Гисса с глюкозой или лактозой, или маннитом, или сахзрозой или мальтозой сбраживает только глюкоза и

45 мальтоза с образованием кислоты без газа.

Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот.

Генетической особенностью штамма является его ауксотрофность по цистеину.

50 Не нуждается в витаминах.

Оптимальная температура роста 36—

37 С, Рост возможен при рН среды от 6.2 до

7,2. оптимум 7,0.

Аэроб, оптимальный для роста является

55 концентрация растворенного в среде кислорода 5-207,.

Штамм синтезирует группоспецифический В-полисахарид и большой набор белков с различной молекулярной массой, среди которых преобладает белок с молеку1708846 лярной массой 41 кц, относящийся к серотипу 2, является продуцентом полисахаридбелкового комплекса.

При испытании на белых мышах весом

12-14 г по тесту острой токсичности штамм токсичен. LDw составляет 4 — 13 млрд. клеток.

Групповая специфичность штамма.

Штамм дает положительную реакцию агглютинации на стекле (3-4 креста) с менингококковой гомологичной серогруппы В сывороткой и не агглютинируется с сыворотками других серогрупп: А, С, О, Х, У, 2, 29Е, W — 135, На основе культуры менингококка серогруппы В предложенного штамма получают кроличьи иммунные сыворотки, группоспецифический полисахарид.

Антигенную активность культур изучают через грунпоспецифическую активность сывороток. В табл,1 представлены данные реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) титрования сывороток менингококковых серогруппы В, полученных при иммунизации кроликов культурами менингококка предлагаемого штамма, в сравнении с аналогичными данными на известных штаммах. Из таблицы видно, что в этом тесте наблюдается высокая специфичность и активность сывороток. Кроме этого, можно отметить значительную разницу в титрах антител между сыворотками, полученными при иммунизации культурами менингококка предложенного штамма, и сыворотками, полученными к известным штаммам.

Результаты реакции агглютинации на стекле и по Ноблю полученных нами сывороток с 46 штаммами различных серогрупп также свидетельствуют о высокой активности и строгой групповой специфичности.

Из культуры менингококка предложенного штамма известным методом выделяли препараты полисахаридно-белкового комплекса.

В указанных препаратах определяли пептидный состав с помощью электрафореза s полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия. При . анализе денситограмм указанных комплексов выявлено, что во всех препаратах присутствует основной пептид с молекулярной массой 41 КД, Результаты изучения молекулярных параметров и антигенной активности В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса, выделенных из биомассы менингококка предложенного штамма, выращенного в синтетической питательной среде, приведены в табл.2 и 3.

Из табл.2 видно, что полисахарид, выделенный из предложенного штамма, содержит в 1,5 раза больше высокомолекулярного вещества, чем полисахарид из известного штамма. В-полисахариды из биомассы менингококка серогруппы В предложенного штамма были использованы для получения эритроцитарного диагностикума, который характеризовался высокой специфичностью и активностью, Это еще раз подтверждает, что предлагаемый штамм является продуцентом активного в антигенном отношении группоспецифического В-полисахарида.

Пример. Модифицированную среду

Коэн-Веллер (см.выше) в объеме 6 л в ферментере засевают 100 мл инокулята, содержащего 6 х 10 кл/мл. Инокулят получают смыванием с 5 чашек Петри 18-часовой ном агаре Хоттингера.

Культивирование проводят при 37 С, рН 7,0 — 7,2 до конца экспоненциальной фазы роста, которую затем поддерживают непрерывно-синхронным способом в течение

72 ч.

Последнее осуществляют следующим образом.

Выращивание штамма ведут при постепенном увеличении частоты вращения мешалки от (70 об/мин в начале процесса до

450 об/мин в конце экспоненциальной фазы роста). Растворенный в среде кислород от первоначального насыщения 50-60% снижается к 1 — 2 ч роста до значений, близких к

10 . В дальнейшем процесс до 5 — 6 ч роста ведут в данных условиях. К 5 — 6 ч роста (оптическая плотность (ОД) достигает значений, равных 2+0,2. B этот момент из ферментера сливают половину объема куль40 туры (3 л) и доливают свежую питательную среду до прежнего объема (6 л). После долива питательной среды ОД становится равной 1» 0,1. Через 1 ч ОД культуры достигает уровня, существовавшего до первого слива

45 культуры, т.е. 2 0,2. Время генерации 1 ч.

В дальнейшем такие сливы культуры с последующими доливами свежей питательной среды производят периодически через

1 ч до получения необходимого объема культуры, В момент долива питательной среды, т.е. в начале каждого цикла уровень растворенного в среде кислорода поднимается до

20 от полного насыщения, затем через 1 ч в момент слива уровень растворенного в среде кислорода падает до 10%.

Для получения 1 r полуочищенного полисахарида менигококка серогруппы В при

20 культуры, выросшей на 20%-ном сывороточ1708846

Таблица 1

Таблица 2 культивировании предложенного штамма в указанных выше условиях необходимо 20 л культуры с оптической плотностью не менее

2 + 0,2, которую можно получить за 10 — 12 ч культивирования в ферментере. 5

Использование предложенного штамма

N.meningltldls позволяет получить наиболее качественную в антигенном отношении биомассу менингококка и в большем количестве в сравнении с биомассой менингококкэ 10 известного штамма, так как выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в

1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Кроме того, уровень антител 15 к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных,. полученных к полисахаридно-белковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза

20 превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахариднобелковому комплексу штамма известного.

Следовательно, процессы получения на основе предлагаемого штамма сывороток, Вполисахарида, необходимого для производства эритроцитарного диагностикума, и иммуноферментных тест-систем, а также В-полисахаридно-белкового комплекса, идущего на приготовление менингококковой В-вакцины, будут в 2 — 3 раза более

ЭКОНОМИЧНЫМИ.

Формула изобретения

Штамм бактерий Neisserla menlngltldis серогруппы В N. 125 (коллекция ГИСК им.

Л.А.Тарасевича) — продуцент капсульного полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса.

1708846

Таблица 3

Составитель Л.Минеева

Редактор А.Долинич Техред М.Моргентал Корректор М,Кучерявая

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушскэя наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101