Способ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале

 

Изобретение относится к области биохимии, медицинской биологии, медицины и сельского хозяйства и предназначено Для точного количественного определения адениловых нуклеотидов в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных. Целью изобретения является повышение чувствительности, информатив-нести за счет одновременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, экономичности. Цель изобретения достигается путем приготовления экстракта, проведения реакции дансилирования пробы с 0,5%-ным ацетоновым раствором 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1:1, рН 10-12 и инкубации в темноте при '30 - 40°С, хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографИческой смеси 1,4-диоксанизопропанол-аммиак-вода в соотношении 40:10:8:22, с последующим флуориметрическим определением количества аденил^овых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом. Предлагаемый способ в 1000 раз повышает чувствительность определения по сравнению с нефлуоресцентными аналогами. 6 табл.(ЛсИзобретение относится к биологии, медицине и сельскому хозяйству и предназначено для точного количественного определения аДениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных.Цеяъю изобретения является повышение чувствительности способа, информативности за счет одновременного определения АТФ, АДФ и АМФ в одной пробе.Способ осуществляют следующим образом.Исследуемые образцы (калибровочные растворы, экстракты из органов и тканей), содержащие адениловые нуклеотиды, смешивают с 0,5%-ным ацетоновым растворомдансилхлорида

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (1!) (и)ю G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4729896/14 (22) 04.08.89 (46) 30.01.92. Бюл. N. 4 (71) Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения АН СССР (72) А;Г.Ткаченко (53) 616.07 (088.8) (56) Randerath К., Randerath Е. Jon exchauge

chromatography ion poly (etilenimin)—

cellulose thin layers — J.(.hromatogr, 1964, v.16. р.111 — 125. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИЛОBblX НУКЛЕОТИДОВ 8 БИОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к области биохимии, медицинской биологии, медицины и сельского хозяйства и предназначено для точного количественного определения адениловых нуклеотидов в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных. Целью изобретения является повышение чувствительности, информативИзобретение относится к биологии, медицине и сельскому хозяйству и предназначено для точного количественного определения адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) в биологических объектах, в том числе органах и тканях человека и животных.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа, информативности эа счет одновременного определения АТФ, АДФ и АМФ в одной пробе.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемые образцы (калибровочные растворы, экстракты из органов и тканей), содержащие адениловые нуклеотиды, смешивают с 0,5 -ным ацетоновым раствором ности за счет одновременного определения

АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе. экономичности. Цель изобретения достигается путем приготовления экстракта, проведения реакции дансилирования пробы с 0,5$-ным ацетоновым раствором 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1:1, рН 10 — 12 и инкубации в темноте при 30 — 40 С, хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографической смеси 1,4-диоксанизопропанол-аммиак-вода в соотношении

4Î:10:8:22, с последующим флуориметрическим определением количества аденидовых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом.

Предлагаемый способ в 1000 раэ повышает чувствительность определения по сравнению с нефлуоресцентными аналогами. 6 табл. дансилхлорида (5-диметиламинонафталин1-сульфонилхлорид), рН 10 — 12 и инкубируют в темноте при 30 — 50 до обесцвечивания. При этом образуются дансилированные производные адениловых нуклеотидов.

Разделение смеси дансилированных производных осуществляется методом хроматографии в тонком слое силикагеля в системе диоксан-изопропанол-аммиак-вода (4Q:10;8:22). Количество содержащегося в. пятне нуклеотида определяют по величине флуоресценции при облучении хроматограммы ультрафиолетовым светом. Интенсивность флоуресценции может быть измерена любым из способов: прямое сканирование хроматограммы на флуоресцентном спектрофотометре, злюция пятен в

1709218 раствор с последующим измерением на спектрофлуориметре, фотографирование хроматограмм в ультрафиолетовом свете с измерением почернения на негативах с помощью просвечивающего микроденситометра. Чувствительность предлагаемого методасоставляет 0,5-1х10 нуклеотида

-1г . в пятне, что на 2 — 3 порядка выше, чем у прототипа, и равна наиболее широко используемому в настоящее время люциферазному.

Это преимущество сочетается с возможностью одновременного определения трех аденилатов в одной пробе. Разработанные условия дансилирования являются избирательно оптимальными для адениловых нуклеотидов, что в сочетании с предлагаемой системой растворителей, дающей более качественное, чем прототип, разделение (Rf; АТФ-0,17; АДФ вЂ” 0,42; АМФ вЂ” 0,7), гарантирует специфичность идентификации и определения. Воспроизводимость метода составляет 93 — 957,.

Способ иллюстрируется следующими поимеоами.

Пример ",, 10 мкл крови отбираю из пальца человека или ушной вены свиньи и смешивают с 450 мкл раствора HCIOq до конечной 0,4 N концентрации, экстрагируют в течение 25 мин на ледяной бане и цектрифугируют 3 мин при 15000 g, 200 мкл надосадочной жидкости нейтрализуют 2 М

КгСОз и хранят в замороженном состоянии при -16 С до проведения анализа. Предварительно оттаянные и отцентрифугированные (16000 g, 3 мин) экстракты в обьеме

100 мкл смешивают с савкым обьемам

0,5 (,-ного ацетокового раствора даксилхлорида и 10 мкл 3М КгСОД. После инкубации в термостате (37"С в течение 2 ч) пробы (2,5 мкл} наносят на пластины "Siivfoi" (20;; х20 см) и двукратно хроматографируют в смеси I,4-диоксан-изопропанол-аммиаквода (40:10:8;22 по обьему), Высушенные хроматограммы фотографируют в ультрафиолетовом свете мокохроматорл КФ-4 (СССР), Полученные негативы декситометрируют на микрофотометре MD-100 "Kari

Ceizz", (ГДР) с интегратором, показания которого заранее калибруют по стандартным растворам аденилатов, Для определения цены деления прибора концентрацию калибровочного раствора делят на показание прибора и подс итывают среднее значение из трех концентраций, К: АТФ = 0,37; АДФ = 0,50: АМФ = 0,27.

При расчете концентрации адекилата в исследуемом образце (экстракте) показания микроденситометра умножают на соответ30

55 ствующий коэффициент и кратность разведения (в данном случае 6).

Пример 2. Печень крыс тщательно перфузируют 0,9Я -ным NaCI, осушают фильтровальной бумагой, навеску 10 мг гомогенизируют в 500 мкл 0,4 NHCI04. Для определения точности метода к полученным экстрактам добавляют стандартные раствори аденилатов в конечной концентрации

20 рМ (внутренний стандарт}. Хроматографирование и измерение количества аденилатов проводят описанным в примере 1 способом, Результаты определения точности и воспроизводимости метода представлены в табл.3.

Образцы с 1 по 4 — параллельно сделанные вытяжки из печени одной крысы.

Результаты измерений на примере экстрактов из печени крыс свидетельствуют о том, что воспроизводимость способа составляет 93 — 85 )ь, а его точность — 97—

98 о

Приводятся примеры обоснования режимов осуществления способа; концентрации добавляемого дансилхлорида (табл.4), рН инкубационной среды (табл.5}, температуры и времени инкубации (табл.б), а также результаты определения чувствительности способа. Последовательным разведением стандартных растворов нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) находят ту предельную концентрацию нуклеотидов, при дальнейшем снижении которой определение данным способом становится невозможным. Установленной таким образом концентрацией определяют чувствительность способа.

На основании результатов исследовакия оптимальной концентрацией дансилхлорида следует считать 0,5;ь, превышение которой не приводило к дальнейшему повы- . шению выхода флоуресценции.

На основании результатов исследования оптимальными значениями рН для проведения реакции дансилирования следует считать рН 10 — 12.

На основании результатов, приведенных в табл,б, обосновывается оптимальный режим температуры инкубации при проведении реакции дансилирования (30 — 40О) и соответствующее время инкубации до окончания реакции (полное обесцвечивание раствора), Результаты определения чувствительности и редлагаемого способа.

Чувствительность метода, моль нуклеотида в пятне: 05 х 10 ; 075 х 10 ; 0,85 х х10; 1 0 х 10; 0,5 х 10 t7O9218

Таблица 1

Определение стандартных растворов нуклеотидов

Таблица 2

Онределегвге концентрации нуклеотндов в экстрактах крови и AMe:

1 — кровьсвнньи. содермвщейсл несбалансированном питательном рационе:

2 — кровь свиньи. содеривщейсл нэ рационе синие ннов íà 50+ калорийности:

Э вЂ” кровь вдорового человека;

4 — кровь больного хроническим бронкнтом.

Таблиц ° 3

AM 4) 4ТФ

Вн7г1нлклетовньгй а. нмоль|мг

Концентрации в экст вте.

6 нттрнклвтовний л л. нмоль/мг

Концентрэцнл в вкст вате М

Внутрикгмточнйй нмольlмг

Концентрэцнл в экст кте

Стан арт

Стан а т

Стэн т

Стэн т бк

227

2,3

2.33

226

2,29

0.016

029

0.31

0.32

028 о,э

001

2.9

3,1 зл

26 зo

0.1

2,86 э.оо

З,О0

2,9

0.037

227

23О

23Л

22.6

22.9

О 13

1.00

0.90

093

0,95

0,94

0.02

28.8

30.0

29.0

3О,О

29.4

0.64

10.0

11.0 10.5

10.4

10.4

О 4

9,9

93

9,5

9.4

0 4

6,t

8.7

8.4

8.6

8.4

0,15

10Î

1СО

104 104,7

2.36

61

87.

86

84,5

1 7

2 з

91 м

Средняя арифметическая; 0,72 х 1012, Средняя ошибка средней арифметической

Q,1 х 1 0 1 .

Средняя чувствительность способа составляет0,72 х10 моль нуклеотида в пят- 5 не.

Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения адениловых нуклеотидов в 1000 раз по сравнению с прототипом, информативность за счет од- 10 иовременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, эко74омичность за счет применения более дешевых и менее дефицитных реактивов и приборов. 15

Формула изобретения

Способ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале путем приготовления экстракта с последующим хроматографическим рээделением, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, информативности sa счет одновременного определения

АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, дополнительно проводят реакцию дансилирования пробы с 0,5 -ным ацетоновым раствором

5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхло— рида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1,1, рН 10 — 12 и инкубации в темноте при 30 — 40 С, а хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографической смеси 1,4-диоксан-изопропанол-аммик-вода в соотношении

40:10.8:22 с последующим флуориметрическим определением количества адениловых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом, 1709218

Таблица 4

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,25 мМ) от концентрации добавляемого дансилхлорида

Таблица 5

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (О,1 мМ} от рН инкубационной смеси

Таблица 6

Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,1 мМ) и времени инкубации от температуры инкубационной смеси

Составитель Н. Теренинэ

Техред М.Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор Ю. Середа

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 421 Тираж Подписное

ВНИИПИ Гссударственного комитета-по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., 4/5