Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактериями рsеudомоnаs species

 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и к технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Целью изобретения являетсястабилизация и повышение выхода конечного продукта. Способ получения человече-- ского лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактериями Pseudomonas species путем глубинного культивирования в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей Гидролизат пекарских дрожжей. D-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенйый к'алий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании РОг при температуре 30±0,5°С, рН 7,0±0,1, определения скорости роста бактерий, заключается в том. что через 15~30 мин после достижения максимальной скорости роста бактериями температуру среды понижают от 30±0,5 до 20±0.5°С и процесс.завершают через 2,5±0,5 ч после снижения температуры, что позволяет стабилизировать и повысить выход альфа-2 интерферона. 3 ил:. 3 табл../• .-вё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s С 12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗО.БРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4649281/13 (22) 08,02.89 (46) 15.02.92. Бюл, М 6 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) }0.É.Римкявичене, К,Л,Вилутис, В.-А.В.Бумялис, С.;Б.А.Пунтежис, С.Л,Григишкис, Э.-В,В.Башкис, Э.-А.А.Янулайтис, Ю.И.Козлов, А.Я.Стронгин и Ю.Д,Цыганков

{53) 615.45: 615,7 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1364343, кл. С 12 N 15/00, 1988.

Авторское свидетельство СССР

N 1616143, кл. С 12 N 15/00, 1989., (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА

АЛЬФА-2 РЕКОМБИНАНТНЫМИ 6АКТЕ

РИЯМИ PSEUI30MONAS SPECIES (57) Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и к технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона. Целью изобретения является

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона.

Цель изобретения — повышение выхода конечного продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

На основании экспериментальных данных разработан способ температурной оптимиэации биосинтеза рекомбинантного альфа-2 интерферона бактериями

Pseudomonas species, согласно которому через 15 — 30 мин после достижения максимальной скорости роста бактерий темпера Ж 1712416 А1 стабилизация и повышение выхода конечного продукта. Способ получения человече- ° ского лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинатными бактериями Pseudo(nones

species путем глубинного культивирования в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей гидролизат пекарских дрожжей, О-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании POz npu температуре 30,5 Ñ, рН 7,0й0,1, определения скорости роста бактерий, заключается в том, что через 15-30 мин после достижения максимальной скоростй роста бактериями температуру среды понижают от 30+0,5 до 20+0,5 С и процесс. завершают через 2,5Ю,5 ч после снижения температуры, что позволяет стабилизировать и повысить выход альфа-2 интерферона. 3 ил-., 3 табл. туру среды понижают от 30» 0,5 до 20,5 C и процесс завершают в начале стационарной фазы или через 2,5 0,5 ч после снижения температуры, достигая максимального биосинтеза интерферона альфа-2, т.е. полностью используя потенциал питательной среды; возможность температурной деградации готового продукта исключается.

На основании известного графического метода было произведено представление на фазовых плоскостях скорости роста бактерий и концентраций продукта. На фиг.1 показана скорость роста продуцента (в 3) от максимальной скорости роста. в табл 1— числовые значения, Спустя определенный

1712416 промежуток времени после того, как бактерии, культивируемые при 300С, достигают максимальную скорость роста, следует снизить температуру до 20 С. Это должно не только исключить деградацию продукта, что характерно для 30-градусного режима ферментации, но и повысить производительность, Из экспериментальных данных (фиг.1 и

3 и табл.1 и 3 видно, что продукт после максимального накопления в клетке практически не подвергается температурной деградации при выращивании культуры при 15 и 20 С, а при выращивании при 25 и 30 С деградация продукта начинается сразу же после его максимального накопления. При снижении температуры до 150С клетки получают слишком большой температурный шок и рост культуры практически прекращается. Культивирование при 15 С замедляет процесс, выход интерферона альфа-2 в 2 раза ниже, чем при 30 С. При снижении температуры да 25 С желаемого эффекта не достигается, так как после накопления продукта наступает его деградация так же, как и при 30 С.

Из фиг.1 видно, что, когда скорость роста снижается до 80/, при ЗО С начинается деградация продукта, а при 20 С в этой тачке увеличивается биосинтез продукта и остается стабильным еще 3 ч(табл.1). При 25 С (фиг.3) получается гибридный вариант, т.е, при снижении скорости роста до 80% происходит увеличение биосинтеза, но потом сразу наступает деградация продукта.

Следовательно, температуру культивирования следует понижать от 30+0,5 до

20ч-0,5 С до начала деградации продукта, т.е, через 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста (табл 1).

Процесс культивирования следует завершить через 2-3 ч после снижения температуры потому, что после 2,5 0,5 ч, но не раньше (табл.2), наступает деградация продукта. Завершение процесса определяется по времени, так как оптическая плотность повышается незначительно.

П р.и м е р. Приготавливают 10 л питательной среды для ферментера "Bios>at Е" емкостью 13,7 л с рабочим объемам 10 л следующего состава, г/л: гидрализат казеина 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей 5; D-глюкоза 10; сернокислый аммоний

3; фосфорнокислый однозамещенный калий

0,6; хлористый натрий 0,5; сернокислый семиводный магний 0,3; хлористый кальций

0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15.

1 л этой среды разливают в 4 250-качалочные колбы и засевают по 1 мл жидкозаконсервированной культуры Pseudomonas

species VG-84. Колбы помещают на 202 ч в термостатирующие качалки при

200М0 об/мин и температуре ЗОМ,5 С.

5 Полученным инокулятом засевают ферментер. К ферментеру подключают бутыли с

10%-ным раствором силиконового пеногасителя, 40%-ным раствором гидроокиси натрия и 35%-ным раствором фосфорной

10 кислоты.

Ферментацию начинают при 30 С, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7, пеногашение на уровне датчика.

Каждые 30 мин беруг пробы культуральнай

15 жидкости для измерения оптической плотности на спектрофотометре СФ-26 при А = 540 нм в кювете толщиной 1 см и определения скорости роста. Оптическую плотность (ПО) изменяют по динамике рос-

20 та: после засева ПО поддерживают на уровне 40%0. от насыщения, при достижении

2,5 — 3 оптических единиц (опт.ед.) — 50% при 4,5 — 5 опт.ед. — 60%, при 6,5 — 7 опт.ед.—

70% от насыщения.

25 ° Скорость роста определяют следующим образом.

Информация об оптической плотности среды поступает на 3ВМ 1BM/РС. Посредством метода сглаживающих кубических

30 сплайнав сглаживают(фильтрация) поступающие данные с точностью до 0.2 опт.ед.

Скорость роста бактерий (V) определяют из выражения х» — х» — 1

V»=

35 т» — т» — 1 где Х» и Х»-1 — фильтрованные сигналы в моменты времени t» и t»-1.

Полученное значение скорости роста бактерий V» сравнивали с предыдущем

"0 значением V»-1. Спустя 15 — 30 мин после удовлетворения условия V» — V»-1 < О температуру среды снижают с 30+0,5 до 20+.0,5 С и процесс биосинтеза завершают в начале стационарной фазы или через 2,5+0,5 ч по45 сле снижения температуры, Таким образом, способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями

Pseudomonas species позволяет полностью

50 использовать потенциал питательной среды и повысить выход конечного продукта в

6 — 7 раз по сравнению с известным спасо6оМ (см. табл.1 и 2 и фиг.2).

Формула изобретения

Способ получения человеческого лей- коцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas

species путем глубинного культивирования в присутствии стрептамицина и тетрацикли11712416 тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, температуру среды понижают до 20+0,5 С после достижения максимальной скорости роста бактерий, а

5 процесс культивирования завершают через

2,5ь ),5 ч после снижения температуры. на на питательной среде, содержащей гидролитат. пекарских дрожжей. О-глюкозу, сернокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый натрий, сернокислый семиводный магний и хлористый кальций при регулировании Р02 и npui

ЗОн-0,5оC, рН 7,0+0,1, отличающийся

Табли ца 1

Кинетика роста бактерий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

2O C 30 С

INF

Е/л - l o

t,,ч ПлотСкорость роста INF, ИЕ/л 10

9 опт. еа.

Ф ч

Плотtt ч корость роста ность опт,ед. ность, опт.ед. пт. ед. Ф ч

О 0,3 . 0,35

3 1,62 0,61

4 2,25 О 83

6 4 25 1 08

6,5 4,75 1,27

75 65 . 155

8,5 7,75 1,19

9,5 8,75 1,41

10,5. 11,15 1,15

11 110 047

l1,5 10 75 0,11

12,5 11,25 О, 17

Таблица2.

Кинетика роста бактерий и -биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при снижении температуры с 30 до 20 С

2-й опыт

1-й опыт.

ПО, Скорость роста . INF, опт.ед. МЕ/л 10 опт.ел. ч

Т, С

t,÷ ПО, опт.ед.

Т, С

INF, НЕ/л 10 . ф

Скорость роста

t,ч опт.BQ ° ч

82

16

47

5О

-6

30:

30 3

0,05, 30 3 5

0,21 : 30 4,25

20 5

055 . 20 55

20 6

1,24 20 6,5 20 .7

1 42 20 7 5

127 . 20 8

О

1,5

2,5

4

4,5

5,5

6,5

7,5

0,93

2,0

5,25

7,62

14,0

16,0

18,5

l9,2

20,8

22,5

22,2

22,5

0,24

2,02

4, 9

5, l3

5 90

4,67

3,40

2э72

2,51

1,45

О,45

0,28

23

54

8г

77

74

31

11

4 34

71

87

79

58

46

43

0 64

1,2

1 9

2,4

2,5

2,1

О

4

5 5

6,.5

7.

7,5

8,5

9,5

10,5

0,43

l,o .3 5

5,75

7,37

8,25

11,0

12 5

13;1

14,О

14,6

14,О

0,62

1,37

3,37

4,о

7i0

11,0

12,.75

13,05

13,75

15 5

16,25

15,г5

О, 17

0,77

1,80

2,68 . З,oá 3,3.9, .3,28

2 59

1,8о

0,56

-0,38

-o,47

0,21 1,61

1 34

2,69

5,43

4,46

1,89

0,85

2,55

2,69

0,23

-0,33

5, гз

53

79

97

76

53

17

-10

-14

1,0

У

1 5

2,1

1,95

1,1

0,07

0,2

0,35

О 76

0 93

1 50

- 30

30, 30

1712416

Таблица3

Кинетика роста бактерий и биосинтез альфа-2 интерферона (INF) при разных температурах

25 C

15 С

INF

МЕ/л 10

ПО, опт.ед. Скорость роста

INF

МЕ/л ° 10т

ПО, опт.ед.

Скорость роста й,ч сыч опт.еа. ч опт.еа. ч

0 .

2,5

4

4,5

6,0 6,5

7>5

8,5

9,5

10 5

l1, 11,5

1 92

2,87

3,0

3,6

4, 12

5,4

6,24

6,75

7,5

8,25

9,2

9,8

10,1

10 5

10,65

0,06 22

0,04 14

О,10 36

0,16 57

0,14 50

0,28 100

0,08 29

0,25 90

0,25 90

0,16 57

0,20 70

0,10 36

0,13 «7

0,05 18

1

0,96 . 0,96

1,20 2,5

1,21 3 5

1,1. 4,5

1,3 5

5,5

1,27 6

1,28

1,8

2,0

2 75

3,62

4,62

6 50

8,0

9,62

10,12

I1,0

11,25

11,25

0,03

0,25

0,29

0,33

0,62

0,50

0,54

0,16

0 3)

0,08

47

53

87

26

13

0,5

1,1

1,54

1 55

2,8

1 77

1,45

1712416

ИЕ/ИО

0 2 Ф г

Составитель К; Вилутис

Редактор Л. Пчолинская Техред M.Ìîðråíòàë Корректор 0, Кундрик

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Ф