Способ деконтаминации микобактериальных культур

 

Использование: микробиология, выделение чистых культур сапрофитных и условно патогенных микобактерий из контаминированных первичных культур. Сущность изобретения: готовят двухмиллиардную взвесь контаминированной микобактериальной культуры. Пропитывают ею батистовые тест-объекты и подсушивают. Тест-объекты помещают в пробирки с раствором Дезоксона-4 в концентрациях 0,1- 2%. После обработки Дезоксоном тест-объекты извлекают из пробирок, промывают дистиллированной водой и помещают в пробирки с 10 мл среды Линниковой. Пробирки со средой культивируют при 37°С в течение 5-7 дней, полученные культуры окрашивают по Цилю-Нильсенуи микроскопируют. Макобактериальная культура считается чистой, если в 20 полях зрения нет посторонней микрофлоры. 3 табл.

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 1/20

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИ Т ЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4800222/13 (22) 06.03.90 (46) 07.04.92. Бюл М13 (71) Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР (72) А.Л.Лазовская, А,А.Бондаренко, В.С.Ка- саткин и Б.В.Емельянов (53) 576,8,093,38 (088.8) (56) ТУ 6-02-1283-84.

Справочник ветеринарного лаборанта;

/Под ред. В,Я.Антонова.— М,: Колос, 1981, с, 46 — 71. (54) СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИИ МИКОБАКТЕ P ИАЛ Ь Н ЫХ КУЛ ЬТУР (57) Использование: микробиология, выделение чистых культур сапрофитных и условно патогенных микобактерий из

Изобретение относится к лабораторным исследованиям и может быть использовано для получения чистых культур сапрофитных и условно патогенных микабактерий иэ контаминированных первичных культур.

Известен способ деконтаминации микобактериальных культур по Дригальскому путем дробного посева в чашки Петри.

Недостатком этого способа является . низкая эффективность, обусловленная тем; что микобактерии растут группами, которые из-за наличия склеивающего воскообразного вещества трудно разделить на отдельные клетки для получения гомогенной взвеси, в результате чего в конгломератах сохраняется посторонняя микрофлора, Кроме того, отдельная клетка микобактерий не образует колоний; для этого необходима группа кле Ы 1724685 А1 контаминированных первичных культур.

Сущность изобретения: готовят двухмиллиардную взвесь контаминированной микобактериальной культуры. Пропитывают ею батистовые тест-объекты и подсушивают.

Тест-объекты помещают в пробирки с раствором Дезоксона-4 в концентрациях 0,1.2%. После обработки Дезоксоном тест-объекты извлекают из пробирок, промывают дистиллированной водой и помещают в пробирки с 10 мл среды Линниковой.

Пробирки со средой культивируют при 37 С в течение 5 — 7 дней, полученные культуры окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют. Макобактериальная культура считается чистой, если в 20 полях зрения нет посторонней микрофлоры, 3 табл. ток при посеве не менее 20 —.100 в 1 мл жидкости, Цель изобретения — повышение чистоты культуры, Ь)

Поставленная цель достигается тем, что Дь микобактериальные культуры обрабатыва- 0 ь ют бактериостатиком, в качестве которого QQ используют Дезоксон-4 в концентрации (Я

0,1 — 2,0 об.%, а обработку проводят в течение 5-60 мин.

Способ осуществляется следующим образом, На картофельно-глицериновую среду

Павловского засевают контаминированную культуру микобактерий и выращивают в течение 5-15 дней. Готовят 2-миллиардную взвесь и пропитывают ею батистовые тестобъекты, Через 10 мин тест-объекты извлекают и подсушивают в стерильной чашке

1724685

10

20

50

Петри на фильтровальной бумаге в течение

10 мин, после чего переносят в другую стерильную чашку Петри на фильтровальную бумагу. Чашки с приоткрытой крышкой помещают в термостат для фиксации культур на 20 мин при 37 С.

Тест-обьекты с зафиксированной на них культурой помещают по 12 штук в 3 пробирки с раствором Деэоксона-4 в концентрациях с 0,1 из расчета 2 мл на один тест-объект. Через 5 мин из каждой пробирки извлекают по одному тест-объекту, который помещают в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды на 5 мин с последующим переносом в другую пробирку со стерильной дистиллированной водой на 5 мин, а затем — в пробирку с 10 мл среды Линниковой — Могилевского.

При выборе исходной концентрации препарата учитывают чувствительность к нему основных контаминантов микобактериальных культур, Воздействуя на микроорганизмы, Дезоксон-4 убивает: Escherichia

coll в концентрации 0,001 при экспозиции

15 мин; Stephilococcus aureus в концентрации 0,02 j при экспозиции 20 мин; Bacillus

athrocaides в концентрации 0,03% при экспозиции 15 мин.

Пример 1. На картофельно-глицериновую среду Павловского засевают контаминированную культуру микобактерий и выращивают в течение 5-15 дней. Наличие микобактерий в культуре проверяют микро-. скопией с окраской мазков по Цилю-Нильсену.

Из выросшей микобактериальной культуры готовят 2-миллиардную взвесь в физиологическом растворе и погружают в нее тест-объекты из расчета 10 мл бактериальной взвеси на 50 штук тест-объектов.

Тест-объекты готовят следующим образом. Кусок батиста погружают на 24 ч в холодную воду для удаления аппературы, тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. В приготовленном таким образом куске ткани с помощью иглы выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм, в поперечном — 6 мм. По этим линиям батист разрезают на тест-обьекты, которые по 50 штук раскладывают в чашки Петри, последние заворачивают в бумагу, стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 110 С (0,5 атм).

После погружения через 20 мин в асептических условиях батистовые тест-объекты, пропитанные культурой, переносят на стерильную фильтровальную бумагу(2 слоя на дне чашки Петри), покрывают сверху фильтровальной бумагой, закрывают чашки

Петри крышкой. Для фиксации после удаления избытка жидкости тест-объекты переносят на стерильную фильтровальную бумагу в чашки Петри, покрывают стерильной фильтровальной бумагой и помещают в термостат на 20 мин при 37 С с приоткрытой крышкой.

В пробирке готовят раствор Дезоксона4 на стерильной дистиллированной воде иэ расчета 2 мл на один тест-обьект в концентрациях с 0,1 . В пробирки погружают по 12 тест-объектов. Через каждые 5 мин из пробирок с раствором Деэоксона-4 извлекают по одному тест-объекту и помещают каждый в отдельности в пробирки с 5 мл стерильной дистиллированной воды, через 5 мин их переносят в другие прибирки с 5 мл стерильной дистиллированной воды для отмывки

Дезоксона-4 на 5 мин с последующим погружением в пробирки с 10 мл среды Линниковой-Могилевского, Пробирки помещают в термостат для культивирования при 37 С.

Учет роста проводят через 5-7 дней. Чистоту роста определяют микроскопией мазка с культуры, окрашенной по

Цил ю — Нильсену.

Микобактериальная культура считается чистой, если в 20 полях зрения нет посторонней микрофлоры.

Пример 2, Подготовку культур, деконтаминацию и учет результатов проводят как в примере 1. В трех пробирках готовят растворы Дезоксона-4 в концентрациях 0,1; 1,0 и 2,0% соответственно. Результаты представлены в табл. 1.

Из табл, 1 видно, что рост микобактерий прекращается при концентрации Дезоксона-4 1,0 и экспозиции 30 мин. Микобактериальные культуры. обработанные

Дезоксоном-4 в концентрации 1,0% при экспозиции 20 и 25 мин, дают чистый рост.

Пример 3. Подготовку культур, деконтаминацию. учет результатов проводят как в примере 1. Испытывают следующие концентрации Деэоксона-4 0,.5; 1,0 и 2,0, Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл, 2 при концентрации

Дезоксона-4 2 0 даже при экспозиции 5 мин рост микобактерий отсутствует. Необходимо повторить обработку Дезоксоном-4. выбрав концентрацию Деэоксона-4 в пределах 1,0-2,0 .

Пример 4. Подготовку культур, деконтаминацию, учет результатов проводят, как в примере 1. Испытывают концентрации Дезоксона-4 0,5; 1,0 и 1,5o . Результаты представлены в табл, 3.

Параметры способа обеспечивают уничтожение посторонней микрофлоры, однако микобактерии, обладающие устойчи1724685

Таблица 1

П р и м е ч а н и е. "+" — наличие роста; "—" — отсутствие роста.

Таблица 2. П р и м е ч а н и е. "+"- наличие роста; "-" — отсутствие роста.

Таблица 3

П р и м е ч а н и е. "+"- наличие роста; "—" -отсутствие роста, востлю к широкому спектру химических веществ, включая чистоты, выживают при концентрации препарата, убивающей другие относительно устойчивые микроорганизмы.

Выбор концентрации Дезоксона-4 зависит от характеристик микобактерий. Обработке подвергают контаминированный материал без предварительной идентификации микобактерий, поэтому подбор концентрации Дезоксона-4 начинают с концентрации 0,1, необходимой и достаточной для уничтожения основных комнтэминантов.

Формула изобретения

5 Способ деконтаминации микобактериальных культур путем обработки бактериостатиком, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения чистоты культуры, в качестве бактериостатика используют Дезок10 сон-4 в концентрации 0 1 2,0 об."-,ь, а обработку проводят в течение 5 — 60 мин.