Штамм бактерий рsеudомоnаs rаdiовастеr для получения бактериального удобрения под свеклу

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, касается получения микробиологических средств повышения урожая растениеводческой продукции и представляет собой новый штамм для изготовления бактериального удобрения под свеклу. Целью изобретения является создание нового штамма Pseudomonas radiobacter, позволяющего получить более высокий урожай свеклы. Штамм бактерий Pseudomonas radiobacter выделен из озерного сапропеля/депонирован в ВКПМ под N В-4466. Штамм позволяет получить прибавку урожая кормовой свеклы на 5-41% больше и сахарной соеклы на 5% больше по сравнению с известным штаммом. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) ((l) (s1)s С 05 F 11/08, С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I !

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4715174/13 (22) 05.07.89 (46) 30.03.92. Бюл. М 12 (71) Институт микробиологии АН БССР . (72) Н,И.Мильто и Л.А.Суховицкая (53) 631.847.22:631.85 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1645266, кл, С 05 F 11/08, 1988. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS

RADlOBACTER ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СВЕКЛУ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии; касается получеИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, касается получения микробиологических средств повышения урожая рчстениеводческой продукции и представляет собой новый штамм для изготовления бактериального удобрения под свеклу.

Цель изобретения — создание нового .штамма Pseudomonas radiobacter, позволяющего получить более высокий урожай свеклы.

Штамм выделен из органического озерного сапропеля. Выбор объекта выделения был обусловлен тем, что органические сапропели являются благоприятным субстратом для развития микроорганизмов многих физиологических групп, среди которых име- ются как микроорганизмы-стимуляторы, так и фосфатрастворяющие культуры.

Штамм депонирован Во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика, коллекционный номер В-4466. ния микробиологических средств повышения урожая растениеводческой продукции и представляет собой новый штамм для изготовления бактериального удобрения под свеклу. Целью изобретения является создание нового штамма Pseudomonas

radiobacter, позволяющего получить более высокий урожай свеклы. Штамм бактерий

Pseudomonas radIobacter выделен из озерного сапропеля, депонирован в ВКПМ под

М В-4466. Штамм позволяет получить прибавку урожая кормовой свеклы на 5-41$ больше и сахарной свеклы на 5$ больше по сравнению с известным штаммом. 6 табл.

Штамм имеет следующую характеристику.

Морфологические и культуральные признаки. Мясопептонный агар. Поверхностное культивирование в чашках Петри в термостате при 27 С: колонии 48-часовой культуры гладкие, прозрачные, сероватобелые. Края колоний ровные, профиль выпуклый, консистенция вязкая. Диаметр

Ko/loHVIA 2-3 MM.

Мясо-сусло-агар Условия культивирования те же. При выращивании на этой среде на 2 сут роста колонии круглые, гладкие, прозрачные, серо-белые. Края их ровные, профиль выпуклый, консистенция вязкая.

Диаметр колоний 2-4 мм.

Глюкозо-аспарагиновая среда (состав среды, г/л: глюкоза 10; аспарагин 1,0; Кг304

0,2; MgS04 7НгО 0.2; агар-агар 20,0; вода водопроводная до 1 л). Колонии штамма при культивировании в термостате при 27 С на

4 сут роста округлые, белые, консистенция слегка вязкая.

1?23078

Цитология: грамотрицательные по движные палочки размером 1,5-2,0 х х0,5 мкм, одиночное расположение(18-часовая культура в мясо-пептонном бульоне).

Физиологические и биохимические признаки. Аэроб. Обладает каталазной активностью. Отношение к источнику углерода: использует глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит, лактозу, сорбит, рафинозу с образованием кислот. Способ использования перечисленных углеводов — аэробное окисление.

Не гидролизует крахмал, Не разжижает желатину. Не образует сероводород, аммиак. Образует ацетилметилкарбинол. Восстанавливает нитраты. Слабо пептонизирует молоко. Отношение к источнику азота: усваивает пелтон, аспарагин, глицин, мочевину или аммоний сернокислый в количестве

0,01-0,02 от объема среды.

Растет нэ минеральной среде, содержащей, г/л: (NH4)2HPO4 3,0; КН2Р04 2,0: йаО0,5; MgSO< 7Н200,3; СаС12 6НгО 0,1;

ГеС!з 6Н О 0,01; смесь микроэлементов по Федорову 1 мл (она содержит, г/л дистиллированной воды: НзВОз 5; (NH4)2Mo04 5;

Kl 0,5; Na Вг 0,52; ZnSO< 7НгО 0,2, Ala(SO<)s

0,3, рН среды 6,5.

Штамм развивается в интервале температур 15-30 С. Оптимум — 26-27 C. Оптимум рН 6 0-7,0. Не развивается в присутствии 6,5$ -ного хлористого натрия.

В лабораторных условиях оптимум роста

24-26 С. Признаки штамма устойчивы. Не является антагонистом клубеньковых бактерий и азотобактера.

Способ условия и состав для поддержания и длительного хранения штамма.

В. radiobacter AP хранят и поддерживают методом периодических пересевов (1 раз в полгода) на мясопептонный или мясо-сусло-агар. Последний состоит иэ смеси равных объемов мясопептонного бульона и

4-5 С сусла с 2 агар-агара. Среду стерилизуют при 0,75 атм 20 мин.

Пример 1, Способ получения бактериэльного препарата, Для получения микробо-сапропелевого препарата используют две жидкие среды: мясо-сусло-пептонный бульон для получения расплодки Ps. radiobacter AP и жидкая сапропелевая среда, приготовленная нэ основе органического сапропеля из расчета 2,07 масса/объем по сухому веществу, для получения основной культуры и препарата согласно нижеприведенной схеме:

55 фугируют при 6000 об/мин в течение. 10 мин. Надосадочнуюжидкостьиспользуютдля идентификации и определения количества внеклеточных аминокислот, Рибофлавин в КЖ Ps. radiobacter AP определяют флюорометрическим методом, основанным на способности рибофлавина флюоресцировать в ультрафиолетовом свеСхема получения микробо-сапропелевого препарата

Культура Ps. radiobacter на скошенном мясо-сусло-агаре

5 Культйвирование Ps, radlobacter на жидком мясо-сусло-бульоне на качалке в течение 2 сут (титр 1,40 10 клеток/мл — pac9 плодка) g

Культивирование Ps, radiobacter на

10 жидкой сапропелевой среде на качалке в течение 2 сут(титр 1,63 10 клеток/мл)

Доращивание Ps. radiobacter в стационарной культуре в течение 7 суток (титр

8,25.10 клеток/мл — препарат)

15 Пример 2. Отбор стимуляторов иэ коллекции псевдомонад, выделенных из органического сапропеля, проводят в лабораторных условиях на семенах редиса сорта

Ультра. Семена перед проращиванием об20 рабатывают бактериальными суспензиями проверяемых культур по следующей схеме: штаммы Pseudomonas spp. выращивают на скошенном мясо-сусло-агаре в течение 24. ч, затем готовят их суспензии (смыв с косяка

25 20 мл стерильной воды); семена замачивают в течение 6 ч в бактериальных суспензиях проверяемых культур; семена затем многократно отмывают дистиллированной водой; обработанные семена проращивают на ув30 лажненных фильтрах в чашках Петри в течение 3 сут при 23 С.

Полученные результаты представлены в табл, 1.

Пример 3. Исследован синтез биоло35 гически активных соединений штамма Ps, radiobacter AP следующим образом.

Внеклеточные аминокислоты определяют на аминоанализаторе после культивирования штамма на среде, содержащей, г/л:

40 NH4CI 3,0; глюкоза 50,0; KzHPO40,5; КНгРО4

0,5; СаСОз 3,0; MgS04 0,5; рН 7,0. Среду разливают в конические колбы по 100 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Посевной материал — суспензия 48-часовой культуры

45 Ps.radlobacter AP в стерильной водопроводной воде. Суспензию получают смывом клеток с поверхности скошенного мясопептонного агара, Количество посевного материала 5 об.$. Культуру выращивают на

50 качалке (220 об/мин) при 28 С в течение 5 сут. По окончании опыта культуру центри1723078 те..Величину флюоресценции измеряют после 3-суточного выращивания культуры на среде следующего состава, г/л: глюкоза

10,0; лактоза 3,0; Na-лимоннокислый 3-замещенный3,0; NH4CI 3,0; К2НР040,4; NaCI

3,0; вода дистиллированная до 1 л, рН 7;О.

Среду. разливают по 100 мл в конические колбы и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.

Посевной материал — суспензия 48-часовой культуры Ps. radlobacter в стерильной водопроводной воде. Количество посевного материала 5 об. Культивирование на качалке при 220 об/мин, 28 С, в течение 3 сут. По окончании культивирования центрифугирование при 6000 об/мин в течение

10 мин. Надосадочную жидкость используют для определения рибофлавина.

Полученные результаты представлены в табл. 2.

П р и ме р4, Штамм Ps. radiobacterАР для подготовки посевного материала выращивают на скошенном мясо-сусло-агаре в течение 24 ч. Затем 1 мл водной суспензии микробной культуры засевают колбы с глюкозо-аспарагиновой средой, содержащей осажденные фосфаты железа и алюминия.

Состав среды; г/л: глюкоза 10; аспарагин

1,0; K2S04 0,2; MgS04 7Н20 0,2. Перед стерилизацией среду разливают по 100 мл в конические колбы объемом 250 мл. Стерилизация: 0,5 атм, 20 мин. Для получения осажденных фосфатов навески, содержащие 3040 мг. ИазР04 12Н20 и 2164 мг

РеС!з.6HzO (в случае получения фосфата железа) и 3040 мг йазР04 12Н20 и 1932 мг

AICls .6HzO (для получения фосфата алюминия) растворяют в 25 мл стерильной дистиллированной воды, стерилизуют в фильтре

Зейтца и после этого сливают в одну колбу. . Образовавшиеся высокодисперсные препараты фосфатов вносят по 10 мл в 100 мл среды. Условия культивирования: глубинное выращивание, Ps. radiobacter AP на качалке (220 об/мин) в течение 25 сут при

24-26 С. Содержание PgOs в фугате культуральной жидкости определяют колориметрически с использованием молибденовой сини и двухлористого олова в качестве восстановителя.

Результаты представлены в табл. 3, Пример 5, В производственных условиях определено влияние предпосевной обработки семян кормовой свеклы сорта

Эккендорфская микробо-сапропелевой питательной смесью, приготовленной на основе органического сапропеля и культуры

Ps. radiobacter AP. Титр Рз. radiobacter AP в препарате составляет 8,25+ 0,42 10 клеток/г а.с.в.

Результаты представлены в табл, 4 и 5, Данные, приведенные в табл. 4 и 5, убедительно подтверждают более высокую эффективность использования бакте5 риального препарата на основе штамма Ps.

radiobacter AP под свеклу по сравнению со штаммом ВасПШз megateriurp, Пример 6. Возможность повышения урожая овощных культур путем использова10 ния штамма Ps. radlobacter AP проверяют в вегетационных опытах. Предпосевную бактеризацию семян редиса и моркови проводят непосредственно во время их по, сева в биометр. Агрохимическая характе15 ристика почвы биометра: рНко 7,05. содержание азота: общего 0,08, аммиачного 12,6 мг/кг, нитратного 7,1 мг/кг а.с.в„

Р20в 17,0 мг/100 r почвы, Нагрузка микробной культуры составила для моркови 10, 20 для редисаи10 клеток/семя. б

Семена огурцов сорта. Монастырские перед посевом замачивают в бактериальной суспензии культуры Ps. radlobacter AP и затем высевают в биометр. Почва био25 метра имела следующую агрохимическую характеристику: рНка 5,55,, содержание азота: общего 0,16, аммиачного

15;0 мг/кг, нитратного 8,3 мг/кг а.с,в., PzOs

16,9 мг/100 r почвы.

30 Результаты приведены в табл. 6.

Таким образом, использование штамма

Ps. radiobacter AP по сравнению с известным штаммом дает следующие преимущества, возможность стимуляции всхожести и

35 прорастания семян свеклы за счет образования более мощной корневой системы; воэможность сочетания стимулирующего эффекта за счет продуцирования физиологически активных веществ и трансформации

40 P20s из труднорастворимых фосфатов алюминия и железа, свойственных дерновоподзолистым почвам. Это позволяет стимулировать развитие растений, особенно свеклы в ранние стадии онтогенеза, а

45 также растворять фосфаты полуторных . окислов микробиологическим путем и таким образом обеспечивать доступность фосфора растениям; возможность создания бактериального препарата на основе штамма Рз.

50 radlobacter, который в результате жизнедеятельности микробной культуры, стимулирует развитие и улучшает фосфорное питание растений, особенно свеклы, повышает усвояемость фосфора, фиксированного по55 чвой, и. приводит к увеличению урожая овощных культур и корнеплодов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas

radiobacter ВКПМ В-4466 для получения бактериального удобрения под свеклу.

1723078

Таблица 1

Сравнительная характеристика стимулирующего влияния Pseudomonas spp. на рост корешков редиса сорта ультра в идентичных условиях

* Замачивание семян в воде;

** Штамм Ps.radlobacter AP.

Таблица 2

Синтез биологически активных соединений штаммом Ps. radlohacter AP

Таблица 3

Мобилизация AlP04 и FeP04 штаммом Ps.radlohacter AP в глубинной культуре (мг/100 мл) * Количество фосфора, переведенного штаммом из фосфатов железа и алюминия, вычисляют по разности между его содержанием в опытном и контрольном. (стерильном) вариантах. о

1723078

Таблица 4

Таблица 5

Результаты проверки эффективности применения Bac.megaterlum AP-I u

Ps.radiobacter AP на кормовой и сахарной свекле

Таблица 6

Влияние предпосевной бактеризации семян культурной Ps.radlobacter AP на урожай редиса, моркови, огурцов в вегетационных опытах

Результаты производственных испытаний эффективности Ps.radlobacter AP u

Вас megaterlum AP-I на кормовой свекле, сорт Зккендорфская