Штамм бактерий вrаdyrнizовiuм sp.(неdysаruм) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур . Целью изобретения является создание штамма Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский. Штамм бактерий Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) выделен из клубеньков копеечника альпийского, депонирован во ВНИИСХМ Мг 1406 (для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский). Штамм позволяет увеличить урожай зеленой массы копеечника альпийского на 6,9 ц/га или на 109,5% по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество урожая за счет значительного повышения содержания в нем белка на 7,9%. 4 табл. ч- Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 °

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4727983/13 (22) 04.08;89 (46) 15.03,92. Бюл. М 10 (71) Всесоюзный научно-исследовательский

- институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т. Новикова, В.Л. Князева, А.П. Кожемяков, Л.И. Хоциалова и Н.Г. Орищенко (53) 631.847.211 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

hh 1458359, кл. С 05 F 11/08, 1987.

:(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BRADYRHIZOBlUM SP.. (HE0YSARUM) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД

КОПЕЕЧНИК АЛЬПИЙСКИЙ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, Изобретение относится к сельскохозяй ственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур

До настоящего времени активных и специфичных штаммов Rhlzoblum для усиления симбиотической азотфиксации у копеечника альпийского не было предложено, Известен и используется для инокуляции лядвенца.— кормовой бобовой культуры, произрастающей в ареале распространения копеечника альпийского, штамма

Bradyrhtzobtum sp. (Zotus) 476, Однако он не может быть использован в качестве микросимбионта копеечника аль„, Я2„, 1719387 А1 (st>s С 05 F 11/08, С 12 Ы 1/20 в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, Целью изобретения является создание штамма Bradyrhizobium sp. (Hedysarum) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский. Штамм бактерий

Bradyrhizobium sp. (ledysarum) выделен из клубеньков копеечника альпийского, депонирован во ВНИИСХМ N. 1406 (для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский). Штамм позволяет, увеличить урожай зеленой массы копеечника альпийского на.6,9 ц/га или на 109,5% по сравнению с контролем, Штамм улучшает качество урожая за счет значительного повышения содержания в нем белка на 7,9%.

4 табл. (й пийского, так как не вступает в активный с симбиоз с этой культурой.

Целью изобретения является создание штамма Bradyrhizobtum sp. (Hedysarum) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский, Ю

Клубеньковые бактерии штамма 1406 выделены из клубеньков копеечника альп ийско Го. .Штамм идентифицирован по определи- д телю Берги.

Штамм Bradyrhizobium sp, (Hedysarum)

1406 депонирован в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 1406.

Штамм 1406 растет на питательных средах следующего состава:

1719387

1. Гороховый агар (г/л): горох 100,0; сахароза 20,0; агар 20,0; рН среды 6,8 — 7,0.

2. Маннитно-дрожжевой агар (г/л): маннит 10,0; KzHPO4 0.5; MgSOqx7HzO 0,2; NaCI

0 1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; рН среды 6,8 — 7,0.

3. Маннитно-дрожжевой агар с бромтимолсиним (г/л): маннит 10,0; КгНРО4 0,5;

MgSOnx7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; бромтимолсиний 5 мл

0,50 -ного спиртового раствора; рН среды

6,8-7,0, Культурально-морфологические признаки.

На косом гороховом агаре с рН 6,8-7,0 при 26 — 28 С трехсуточная культура имеет форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами; величина клеток

1,8-2;4 .х 0,6-0,7 мкм, грамотрицательные, до 48 ч подвижные, затем по мере старения к 4 сут — теряет подвижность, монотрихи.

Медленнорастущая культура.

Образование специализированных клеток — при старении культуры на гороховом агаре с рН 6,8-7,0 и температурой 26-28 С в возрасте 10 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде а) по штриху; б) колонии, 1. Гороховый агар, рН 6,8-7,0, Т

26-28 С. а) Штрих пятисуточной культуры обильный, бесцветный, слизистый, стекающий, плоский; б) колонии появляются на 7-е сутки; на

10-е сутки колонии имеют размер 3-4 мм, отнотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слабо растекающиеся, слизистые, S-формы, беловатые.

2. Маннитно-дрожжевой агар, рН: 6,87,0, Т26-28 С; а) Штрих обильный, бесцветный. слизистый, сильно стекающий; б) Колонии появляются на 7-е сутки; на

10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, растекающиеся, слизистые, S-формы, беловатые.

3. Маннитно-дрожжевой агар с бромтимолсиним, Т 26 — 28 С, рН 6,8-7,0. а) Штрих обильный, желтоватый, слизистый, сильно стекающий; б) Колонии появляются на 7-е сутки; на

10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные, круглые, выпуклые. с ровными краями, растекающиеся, слизистые, S-формы, желтоватые, среда желтоватая.

Рост в жидкой среде.

Молоко с лакмусом, Т вЂ” 26-28 С вЂ” среду не пептонизирует, подщелачивает.. Начиная со вторых суток, окраска изменяется в сторону синего спектра. максимальное изменение окраски молока отмечается на 15-е сутки. На поверхности лакмусового молока

5 через 3 сут образуется слизистая прозрачная зона, которая достигает максимальных размеров 10 мм через 15 сут, Физиолого-биохимические свойства.

Микросимбионт. Микросимбионт — бо10 бовое растение копеечник альпийский.

Отношение к: а) кислороду — аэроб б) Т максимальная 40 С минимальная 10 С

15 оптимальная 26-30 С с) рН максимальная 7 5 минимальная 5,0 оптимальная 6,8-7,0

Источники углерода;

20 д е

Глюкоза Ак

Галактоза Ак

Сахароза Ак

Лактоза Ащ

25 Маннит Ак

Сорбит Ак

Рамноэа - Ак

Ксилоэа Ак

Мал ьтоза Ак

30 Клетчатка

Крахмал

Жидкая среда Норриса, Т 26-28 С.

Источники азота йайОз +

35 (NH

Тирозин +

МПА

Азот фиксирует в симбиозе с копеечником альпийским.

40 Другие характерные физиологические особенности обмена.

Воздействие на диагностические суб- . страты: желатину не разжижает, Штамм не патогенен.

45 Штамм 1406 хранится на бобовом агаре указанного выше состава рН 6 8 — 7,0 при 4 С и пересеивается-один раз в 6 мес.

Оценку симбиотических свойств штамма 1406- вирулентности, аэотфиксирующей

50 активности и эффективности. симбиоза— проводят в условиях микровегетационных и вегетациончых опытов.

Вирулентность определяют llo количеству и морфологии клубеньков, образован55 ных при инокуляции копеечника альпийского, опытными штаммами клубеньковых бактерий.

Азотфиксирующую активность определяют по величине активности нитрогеназы.

В свою очередь нитрогеназную активность

1719387 измеряют ацетиленовым методом (по ре- Штамм 1406 является активным азатдукции ацетилена) на интактных растени- фиксирующим микрасимбионтом капеечниях. ка альпийского; нитрагеназная активность

Эффективность симбиотической азот- клубенькав, образованных бактериями этофиксации определяют по общему накопле- 5 га штамма на копеечнике альпийском, на 3 нию азота растениями на сосуд, а также по порядка выше, чем у растений, инакулировеличине урожая зеленой массы копеечника ванных штаммом 476. альпийского и содержанию в ней азота, ко- Нитрогеназная активность копеечника торий определяют с помощью системы альпийского, инокулированного штаммом

Кьельтек-аута-Текатор (Швеция), 10 476, была на уровне контрольных растений, Пример 1. Микровегетационный следовательно, бактерии этого штамма не опыт. обладают азотфиксирующей активностью в

В большие пробирки с 5 r стерильного симбиозе с данной бобовой культурой. вермикулита добавляют 11 мл среды Кра- Результаты микравегетационного сильникова-Кореняко следующего саста- 15 опыта по определению общего накоплева, г/л: К2НР04 1,0; MgS04x7Hz0-1,0; ния азота копеечником альпийским, бактеCaz(P04)z-0,2: 1 мл смеси микроэлементов ризованным вышеупомянутыми штаммами, по прописи М.В. Федорова, г/л: НзВОз 5,0; представлены в табл. 2. (NH4)2Mo04 5.0; K J 0.5; Na Br 0,5; Как показывают данные этой таблицы, в

Уп304х7Н20 0,3; Alz(S04)zx18HzO 0,3; 20 результате активной фиксации атмосферноMnS04 0,2; CuS04 0,2. Стерилизуют в авто- ro азота клубеньковыми бактериями штамклаве. Семена копеечника альпийского ви- ма 1406 в симбиозе с копеечником дообразца иэ ВИЛР скарифицируют и альпийским улучшалась обеспеченность стерилизуют концентрированной серной растений азотом, благодаря чему общее кислотой в течение 3 мин, промывают сте- 25 накопление азота в них было íà 124 вырильной водой и раскладывают на увлаж- ше. чем при использовании штамма 476. ненные стерильной водой бумажные Приэтомуражайзеленоймассы растений, фильтры в чашках Петри для прорастания. инокулираванных штаммом 1406, повыЧерез двое суток проращивания в асептиче- сился на 36,2%, а содержание азота в ней ских условиях раскладывают в пробирки со 30 на 1,25 . средой (по 2 проростка). Опыты ставят в В клубеньках растений, инокулиро10-ти кратной поверхности. Клубеньковые ванных штаммом 476, симбиотическая бактерии для инокуляции растений выращи- азотфиксация отсутствовала, растения- довают на косом гороховом агаре в пробирках полнительно не снабжались азотом из возв течение 3 сут при 28 С и суспендируют в 35 духа, в результате продуктивность растворе микроэлементов. Через двое суток копеечника альпийского в этом варианте не после посева семян в каждую пробирку с увеличилась. растениями вносят по 1 мл инокулюма, име- Приведенные материалы свидетельстющегоконцентрацию10 клеток в1 мл. Рас- вую т о том, что активная симбиотическая т тения выращивают в фитотроне при 40 азатфиксация у капеечника альпийского

22-24 С. Через 48 дней пробирки герметич- может быть получена только при анокуляно закрывают и вводят шприцам ацетилен ции специфичными для него штаммами до концентрации 10 по объему. Количест- клубеньковых бактерий. Ввиду этого в во этилена, образовавшегося в результате дальнейшем опыты штамм 476 не включалвосстановления ацетилена нитрогеназной 45 ся. клубеньковых бактерий, определяют через Пример 2. Вегетационный опыт

24 ч на газовом хроматографе "Цвет- . провадиливсосудахс6кгдерновоподзоли100". Величину нитрогеназной актив- - стой почвы с внесением солей па прописи ности клубеньков, которая характеризует Прянишникова, но без азата, г/кг почвы: KCI азотфиксирующую активность штаммов, 50 0,15; MgSO4 0,06; СаНРО 0,172: MnSO4 выражают в микромолях CzH4 за 24 ч на 0,003; барная кислота 0,003 (NH4)zMo0< сосуд. Результаты представлены в табл. 1. 0,001. Повторность опыта 4 кратная. ИсКак показывает табл. 1, бактерии пред- пользовали семена капееч ника альпийско лагаемого штамма 1406 вирулентны на капе- го видообразца из В ИЛР, Для инокуляции ечнике альпийском: они образуют на его 55 семян использовали чисту а культуру баккорнях типичные для этого растения клу- терий на скошенном гороховом агаре. беньки, а бактерии известного штамма 476 Культуру в пробирках с титром 4 — 5 млрд вэтихусловияхслабовирулентны: образуют смывали водопроводной водой, затем сусбелые, мелкие клубеньки не на всех расте- пензию наносили на семена капеечника ниях. альпийского, разложенные в лунки, сде1719387 ланные в почве каждого сосуда. В сосуд вносили 10 клеток.

Данные по эффективности инокуляции копеечника альпийского в вегетационном опыте штаммом 1406 представлены в табл. 5

3.

Из табл. 3 следует, что штамм 1406 вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским, усиливает у него процесс симбиотической аэотфиксации и 10 благодаря этому свойству способен увеличивать продуктивность растения-хозяина: урожай зеленой массы повысился на

124,4, содержание азота в растениях на

1,02 . 15

Пример 3. Получение препарата на основе штамма 1406.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или пятилитровых бутылях в течение 2 сут на среде следующего состава, 20 мас.ф,: гороховый отвар 10,0; сахар (пищевой). 1,0; {МН4)2$04 0,5; КН2Р04 0.05;

К2НР04хЗН20 0,05; M g $ 04х7Н20. 0,02;

СаСОз 0,1; вода водопроводная до 100.0; рН после стерилизации (1,0 ати, 30 мин) 6,8-7,0. 25

Титр клеток 4-5 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят s пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас. : кукурузный 30 экстракт 1; меласса 2,0; (NH4)2$04 0,1;

КН2Р04 0,025; К2НР04х3Н20 0,025;.

Мо$04х7Н20 0,02; СаСОз 0,1; вода водопроводная до 100,0; рН после стерилизации

6,8-7,0. 35

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5 . Бутыли встряхивают на качалке в течение 48-60 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 36-48 ч при 28-30 С, 40

Титр 4-5 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость иэ бутылей или ферментаторов — инокулюм. используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низин- 45 ный торф, нейтрализованный мелом до рН

6,8-7,0, с влажностью 30-40 в полиэтиленовых пакетах по 200-400 r стерилиэуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад, Стерильный торф в пакетах инокулируют 50 инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса. {6 () иэ расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60 . Затем пакеты загружают в специальные смесители, при 55 вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 сут при 15-20 С;

Риэоторфин хранят при 3-8 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикагов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для копеечника альпийского на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде, Влажность готового препарата 50-55 . Ризоторфин содержит

3-4 млрд клубеньковых бактерий на 1 r торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Пример 4.

Конкретное использование штамма в полевых условиях.

Влияние штамма 1406 на урожай копеечника альпийского изучают в полевом опыте на дерново-подзолистой почве. Площадь делянки 20 м2. повторность опыта 4-кратная. Вносят минеральные удобрения

Р 120К120.

Использу.эт семена копеечника альпий ского. Семена обрабатывают торфяным препаратом-ризоторфином, изготовленным на предлагаемом штамме. Доза препарата

200 г на гектарную норму семян, титр препарата 4 млрд/г.

- Способ внесения препарата: 200 r ризоторфина разводят в 1,0 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата.

Обработанные ризоторфином семена вйсевают в тот же день во влажную почву, Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 1406 с копеечником альпийским определена по величине урожая зеленой массы растений так называемого лекарственного сырья, куда входят листья. тонкие стебли, бутоны и цветы, а также по содержанию белка в сырье.

Штамм 1406 является видоспецифичным по отношению к копеечнику альпийскому, по сравнению с ранее описанным, т. е. известный штамм не вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским.

Поэтому в полевом опыте было лишь два варианта: контроль, где растения могли инфицироваться природной популяцией ризо-. бий, и вариант с инокуляцией штаммом

1406.

Данные табл. 4 показывают, что штамм

1406 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором. Улучшение азотного питания копеечника альпийского за счет боЬее интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожайность растения-хозяина, так и на его качество.

Урожай зеленой массы копеечника альпий1719387

1.0 азотфиксирующим микросимбионтом копеечника альпийского и может быть использован для получения бактериального удобрения под это растение. ского при инокуляцни этим штаммом повышается на 6,9 ц/гз или на 109,5%. Штамм улучшает качество урожая за счет значительного повышения содержания в нем белка на7,9 . 5

Таким образом штамм Bradyrhizobium зр. (Hedysarum) 1406 существенно увеличивает азотфиксирующую активность копеечника альпийского, повышает его продуктивность, что указывает на то, что 10 предлагаемый штамм является активным

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhlzobl. sp. (Hedysarum) ВНИИСХМ 1406 для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский.

Таблица 1

Вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 1406, 476

Вирулентность

Варианты инокуляии

Азотфиксирующая активность

Количество клубеньков на одно растение. штук

Нет

Характеристика клубеньков

Нитрогеназная активность, мкмоль

С2Н4 сосуд/24 ч*

0,004

3,34

Без инокуляции

Штамм 1406

Крупные до 3 мм, цилиндрические, розоватые

Мелкие, до 1 мм, округлые, белые, не на всех астениях

Штамм 476

0,005

НСРо,ы

0,30 мкмоль/сосуд

Таблица 2

*р-4,3 $.

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 1406 и 476 р 3,0 ; HCPos 2,2 мг/сосуд

Таблица 3

Эффективность симбиоза штамма 1406 с копеечником альпийским

1719387

Таблица 4

4

Влияние штамма 1406 на урожайность копеечника альпийского .Составитель С.Левин

Редактор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор М,Максимишинсц

Заказ 739 Тираж, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101