Штамм бактерий bacillus suвfilis для получения препарата против возбудителей заболеваний хлопчатника

 

Использование: микробиологическая промышленность, получение средств защиты растений, в частности хлопчатника, от возбудителей заболеваний. Штамм выращивают на сусло-агаре при рН 6.8-7,0 в течение 7-10 сут .при 28-32°С, смывают выросшие колонии физиологическим раствором и готовят суспензию с тиром (2-3)v «10 кл./мл. В суспензию вносят криолротектор (сахарозожелатиновую среду) и лиофилизируют. Для обработки семян хлопчатника лифилизированную культуру разбавляют водой до содержания 5,0«10 - 1, кл./мя. Длявбработки 1 т семян хлопчатника используют 500-700 л рабочей суспензии. Препарат на основе штамма позволяет защитить хлопчатник от возбудителей кормовой гнили на 93-94%, вертициллезного вилта на 85.2-86%. 7 табл.. со С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я}5 А 01 N 63/00, С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4814336/13 (22) 22.,02.90 (46) 07;03.92. Бюл. N 9 (71) Институт микробиологии и вирусощ}гии им. Д.К.Заболотного и Таджикский сельскохозяйственный институт

-(72) В.B.Ñìèðíîâ, М.Я.Менликиев, С;Р:. Резник, В .А.Вьюницкая, Г.М,Ваньянц, М.Х.Султанова. А,Джумаев и Н.У.Шарипова (53) 576.8(088.8) (56) Патент США № 4663162. кл. А 01: и

63/00, 1986. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАСКЫ3

SUBTILIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

П РОТИ В ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛ Е ВАНИЙ ХЛОПЧАТНИКА (57) Использование: микробиологическая промышленность, получение средств защиИзобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к защите растений хлопчатника от поражения фитопатогенными грибами.

В качестве наиболее распрострайен-. ного метода предупреждения грибных болезней хлопчатника используется протравливание семян химическими препаратами (формалином, бропокотом, бройокотом с ксантаном, бропокотом с ГМТД).

Известен способ предпосевной обработки семян хлопчатника синтетическим препаратом с целью повышения семян.

: Однако химические способы имеют ряд существенных недостатков: высокая токсичность для человека и животных, накапливание в почве и растениях остаточных количеств ядовитых веществ, сложная техБЫ, 1717156 А1

2 ты растений, в частности хлопчатника, от возбудителей эабоаеваний-;.Штамм выращивают на сусло-агаре при рН 6,8-7„0 в течение 7-10 сут.при 28 -32 С, смывают выросшие колонии физиологическим раствором и готовят суспенэию с тиром (2-3)r х10 кл./мл. В суспензию вносят криопротектор (сахарозожелатиновую среду) и лиофилизируют ..Для обработки семян хлопчатника лифилизированную культуру разбавляют водой до содержайия 5;0 10

- 1,0 109 кл./мл. Для обработки 1 т семян хлопчатника исйользуют 500-700 л рабочей суспензии. Пpenaðaò нв основе штамм а позволяет защитить хлопчатник от возбудителей кормовой гнили на 93-94 ; вертициллезного вилта на 85.2-86 . 7 табл.. нология протравливанйя,. неэффективность против загнивания семян, гнили проростков и корневой: гнили всходов:, высокая стоимость и др.

Известны биологические. способы борьбы с различными болезнями растений, в том числе вызываемыми грибами. Способ борьбы с черной ножкой, корневой гнилью, шейковой гнилью основан на использовании препарата иэ 1rIchoderma harz1anum Т вЂ” 315 (АТСС ¹ 20671).

Однако они. не эффективны для защиты растений хлопчатника от таких. болезней, как вертициллезный вилт, фузариозное увядание и др.

Наиболее близким к изобретению является способ применения ВасИЬв polymyxa

9А для защиты растений от вертициллезно1717156

45

55 го увядания. В. polyrnyxa 9А, выделенная из корней растений картофеля, росших на участках, сильно зараженных Vertlcllliurn

dahliae, обладает способностью подавлять развитие вертициллеэного увядания на таких культурах, как картофель и хлопчатник.

В. polymyxa может быть использована в форме водных и неводных препаратов.

Водные препараты содержат 10 — 10

5 9 кл/мл, а пасты 10 кл/мл. Неводные препад раты включают дусты, смачивающие порошки, гранулы, эмульгоконцентраты, Рабочие составы могут применяться в виде растворов. гранул, дуста. Чаще всего составы используют для непосредственной обработки семен и семенного материала, хотя не исключается возможность. обработки почвы вокруг посадочного материала.

Однако данный способ не включает предупреждение таких болезней хлопчатника, как черная корневая гниль и фузариозное увядание, - Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более широким спектром действия к возбудителям заболеваний хлопчатника.

Поставленная цель достигается использованием для предпосевного увлажнения семян хлопчатника суспензии полученной новой живой культуры Sacillus subtilis 260 с содержанием 5 10 — 1 10 кл/мл, применяемой в количестве 0,5-0,7 л на 1 кг семян при экспозиции 12-18 ч.

Штамм В.subtllis 260 получен из внутренних тканей стебля здорового растения хлопчатника в лабораторных условиях. После предварительной обработки и стерилизации поверхности стебля стерильным скальпелем снимали кору, и небольшие кусочки стебля помещали на поверхность пи- 4 татвльного агара (картофельного агара) в чашку Петри. Чашки инкубировали при 28 С в течение 5-7 сут.

Штамм идентифицирован по определителю Берги (1984), на основании работ

Gordon (1973), депонирован в коллекции.

Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под ¹ 128.Штамм В. зо ЫПэ 260 имеет следующие основные культурально-морфологические и биохимические признаки. Грамположительные подвижные аэробные спорообразующие палочки с закругленными концами, продуцирующие каталазу. Образуют эндоспоры, не раздувающие клетку. Размер клеток — 1,9х0,5 мкм; в мазках 18 ч культуры клетки. расположены одиночно, попарно, реже в цепочки. Споры в клетке расположены центрально, размер спор 0,9х0,5 мкм.

При культивировании штамма на МПА в течение 24 ч при 37ОС образуются складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии изрезаны, На среде

Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), рН 6,8-7,0 после 24 ч термостатирования при 37 С образует кремово-белые колонии, складчатые, с кратерообразным центром, консистенция вязкая, края колонии изрезанные. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилазу, мальтозу, галактозу, лактазу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа; не разлагает дульцит, рамнозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауера, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину; утилиэирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения полиР-оксимасляной кислоты на среде МПА с глюкозой.; не образует индол и сероводород. Не обладает лецитиназай, каагулазай, гиалуранидаэой. Патогенными свойствами (токсическими, таксигенными, вирулентными) при парентеральнам и пероральном введении белым мышам не обладает.

Проверка безвредности осуществлялась следующим образом.

Лабораторным животным вводили фильтрат культуральной жидкости В.

suhtiiis 260, выращенной в течение 10 сут на мясо-пептаннам бульоне при 28 С; суспензии клеток В. subtilis 260, выращенной на мясо-пептоннам агаре при 28 С в течение 24 ч, суспензии инактивираванных прогреванием клеток В. subtilis 260, выращенной в течение 24 ч на МПА при

28 С.

Проверку патогенности осуществляли на белых мышах весом 18-20 г. Животным вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекциях.

В табл. Гпредставлены результаты исследования токсичности фильтрата культуры

В. suhtilis 260 после роста на МПБ (токсигеннасть культуры}, В табл. 2 приведены результаты введения животным МПБ (кантроль).

В табл. 3 приведены результаты исследования вирулентности культуры В. suhtilis

260, выращенной на МПА при 28 С в течение 24 ч.

В табл. 4 приведены результаты исследования токсичности инактивираванных клеток культуры В. subtills 260.

Наблюдения за животными проводили на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или пероральнага введения, В период наблюдения все животные были активны, хорошо поедали пищевые рацио-. ны, физиологические отправления у них не

1717156 нарушались, поведенческие реакции были практически не обладающим аллергенным и обычными, изменений со стороны шерстно- общетоксическим действием. го покрова не отмечалось. Динамика йзме- Культура B. subtills 260 пересевается нения массы тела животных в опыте и на среде Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), контроле была сходной. Все подопытные и 5 сусло-агаре, среде Гаузе N 2; рН 6,8-7,0. контрольные животные после окончания Растет при 10-50 С, температурный оптисрока наблюдения были умерщвлены, мум37 С. вскрыты, их органы подвергнуты макроско- Хранится культура .на среде Громыко, пическому изучению. либо среде Гаузе М 2, либо картофельном

Результаты вскрытия показали следую- 10 агаре в течение 2-3 мес при комнатной темщее, пературе, а под слоем стерильного минеСердце обычной формы и величины, у рального масла на укаэанных выше средах подопытных животных такое же, как и у кон- — не менее 1-2 лет. В лиофильновысушенном трольных. Легкие по обьему, строению до- состоянии культура хранится до 3 лет и болей у опытных и контрольных животных 15 лее. Для этого штамм В. subtllis 260 выра. одинаковые ; поверхности легких. гладкие, щивают на среде Громыко или среде Гаузе доли легко отделяются друг от друга, спаек N. 2, или сусло-агаре в течение 5-7 сут при не отмечено. Желудок, петли тонкого и тол- 28 или 37 С. С агаризованной среды биостого кишечника внешне обычные, призна- масса снимается физиологическим раствоков воспалительных изменений не 20 ром. В качестве защитной среды отмечено. При вскрытии просвета виден не- используется сахарозо-желатиновый наполизмененный (такой же. как и у контрольных - нитель. Температура. замораживания не выживотнь!х) рисунок слизистых. Печень тем- ше -25 С, режим высушивания от -25 С до но-красного цвета, среднего кровенаполне- 32 С в течение 32 ч. ния, не увеличена. Доли отделены друг от 25 После хранения под минеральным масдруга, поверхности гладкие. Почки по раз- лом или в лиофилизированном состоянии мерам и форме не отличаются у контроль- культура образует однотипные колонии; на ных и опытных животных, поверхности МПА — складчатые, вязкой консистенции, гладкие, на разрезе виден четкий рисунок телесного цвета, края колонии изрезанные. коркового и мозгового вещества. Селезенка 30 Антагонистические свойства. Антагонине увеличена. обычной консистенции. На стическую активность В. subtilis 260 по отразрезе пульпа умеренно полнокровна, ношению к фитопатогенным грибам темно-красного цвета. определяли методом отсроченного антагоВведение суспензии живых, а также низма, а именно радиальных штрихов. инактивированных клеток 24-часовой куль- 35 Штамм-антагонист засевали в центре чашки туры В. subtllis 260 перорально в дозах 0,5- Петри на среду ГаузеМ2. инкубировали при

1,0 млрд. микробных - клеток и 28 С в течение 72 ч, затем радиальными внурибрюшинно в дозах 0,5-1,0 млрд. мик- штрихами подсевэли тест-культуры, суспенробных клеток на мышь не вызвало у живо- зии которых готовили в физиологическом тных каких-либо признаков заболевания. 40 растворе с содержанием 0,5 млрд. спор в 1

Изучение внутренних органов животных не. мл. Учет результатов проводили по величине выявило у них признаков патологического зоны задержки роста тест-штамма в миллипроцесса и изменений, регистрируемых метрах. мэкроскопически. В табл. 5 приведены данные по антагоВведение мышам фильтрата среды рос- 45 нистической активности В. subtilis 260 по та (после культивирования штамма В. отношению к некоторым фитопатогенным

subtilis 260 на мясо-пептонном бульоне) не грибам. выявило у животных патологического процесса. регистрируемого клинически или при Как видно из приведенных в табл. 5данмэкроскопическомизучени внутренних ор- 50 ных, штамм В. subtiils 260 обладает выраганов животных. женной антифунгальной активностью в

Таким образом, полученные данные да- отношении грибов — возбудителей корневых ют основание отнести изученный штамм к гнилей, фузариозного увядания. вертицил4-му классу по классификации, приведен- лезного вилта. ной в Методических указаниях М3 СССР, 55 Культуру В. subtilis 260 использовали

Главного санэпидуправления "Постановка для получения препарата. исследований для обоснования предельно Препарат на основе В. subtilis 260 допустимых концентраций производствен- представляет собой лиофилизированную ных штаммов и на их основе готовых форм взвесь культуры в физиологическом раствопрепаратов...", т.е. к микроорганизмам. ое NaCI с добавлением защитной среды. В

1717156

Таблица 1

Таблица 2 качестве защитной среды использовали 1; желатины и 1 сахарозы. Культуру В, subtilis 26D выращивали на среде суслоагар (рН 6,8-7,0) в течение 7-10 сут при 2832 С, С агаризованной среды биомассу смывали физиологическим раствором NaCI и готовили суспензию, содержащую 2-3 10

1t клеток в 1 мл. Суспензию соединяли с наполнителем (сахарозо-желатиновой средой). Полученную взвесь разливали в емкости из нержавеющей стали по 300 мл и замораживали при -(25-30) С в течение не менее 24 ч. Проводили лиофилизацию в камере в режиме от (-30) до 32 С в течение 32 ч. Высушенную биомассу помещали в полиэтиленовые пакеты и укупоривали горячим способом.

Для обработки семян хлопчатника бактериальную лиофилизированную культуру за 1-2 ч до начала обработки растворяли в небольшом количестве водопроводной воды с целью оживления бактериальных спор и клеток. Затем из маточного раствора готовили рабочую суспензию, доводя титр до

5,0i10 — 1,0 10 кл/мл. Для обработки 1 т семян необходимое приготовление 500-700 л рабочей суспензии. Обработку семян про изводили либо в имеющейся емкости, либо в специально приготовленной зацементированной яме. Обработку начинали за 12-18 ч до начала сева, В емкость засыпали до 1 т семян и поливали вручную из лейки. Нео6ходимое количество рабочей суспензии использовали в 2-3 приема с интервалом в 4-6 ч, чтобы семена хорошо впитали раствор. . Вслед за каждым увлажнением семян их

5 тщательно перелопачивали и накрывали брезентом. Последнее увлэжнение проводили перед посевом. Если посев задерживался, семена подсушивали, рассыпав их слоем в 5-10 см, а непосредственно перед

10 внесением в грунт их увлажняли водой.

Результаты предпосевной обработки семян хлопчатника с целью предупреждения поражения растений грибными болезнями, повышения всхожести представлены

15 в табл. 6.

Влияние В. subtilis 260 на прорастание семян и пораженность корневыми гнилями.

В табл, 7 приведены результаты предпосевной обработки семян хлопчатника с

20 целью предупреждения поражения растений корневыми гнилями, вертициллезным вилтом, повышения урожайности.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности

25 предлагаемого способа для предпосевной обработки семян хлопчатника.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИ30 ИСХМ i+ 128 для получения препарата против возбудителей заб евэний хлопчатника.

1717156

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Зона заде жки оста, мм тест-к льт ы

Штамм-антагонист

Vertic ill i um баЫвае

Thlelavlopsis

basicola

Fusarium ох s orum 9883

Fusarium ох з orum 6465

23+2,2

24+2,4

29+3,1

15+2,3

В. subtilis 26D

Таблица 6

Влияние В. subtilis 26D на прорастание семян и пораженность корневыми гнилями

П р и м е ч а н и е.1. В качестве тест-культур использовали штаммы фитопатогенных грибов, изолированные из пораженных растений хлопчатника, выращенных в различных районах Таджикской ССР. Штамм Fusarium oxysporum 6365 получен из коллекции Института микробиологии и вирусологии АН УССР.

2, Время наблюдения зон лизиса фитопатогенных грибов 3-10 сут.

1717156

Таблица 7

Составитель В.Смирнов

Техред М,Моргентал. Корректор Э.Лончакова

Редактор Н.Швыдкая

Заказ 829 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Влияние В. subtllls 260 на пораженность растений хлопчатника . корневыми гнилями, вертициллезным вилтом, повышение урожайности