Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства f @
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями. Сущность изобретения заключается в разработке способа получения водорастворимой части человеческого рецептора FcЈ малого сродства (FcЈ R). Способ включает выделение водорастворимой части связывающего IgE фактора (Fct R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей , приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Рс малого сродства, экспрессию дДНК FcЈR, экспрессию мРНК FcЈ R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FcЈ , экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих . ё
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБ 1ИК (я)з С 12 N. 15/12
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР!
y0 u ., g
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4203195/13 (22) 20.08.87 (31) 86111581.4 (32) 21.08.86 (33) EP (46) 15.04.92. Бюл. N. 14 (71) Тадамитсу Кишимото (J P) (72) Тадамитсу Кишимото, Масаки Суемура, Хитоши Кикутани и Эдвард Барсумиан (JP) (53) 675.224.2:577,2 (088.8) (56) Biofutur, 1987, М 54, 9, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОЙ ЧАСТИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА Fc МАЛОГО СРОДСТВА (57) Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы.с местными и системными аллергическими реакциями. Сущность изобреИзобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способам получения полипептидов. пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями.
Способ включает следующие операции.
1. Выделение водорастворимой части связывающего IgE фактооа (Рс R) из лимфобластоидных клеток.
2. Анализ последовательностей водорастворимой части человеческого рецепто-. ра Fc< малого сродства при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей. а9> 5Uно 1 727533 АЗ тения заключается в разработке способа получения водорастворимой части человеческого рецептора Fc малого сродства (1=с R). Способ включает выделение водорастворимой части связывающего IgE фактора (Рсе R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей, приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Fc малого сродства, экспрессию дДНК Гс R, экспрессию мРНК Рс R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора Рс, экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих.
3. Приготовление двух проб гибридизации, Проба 1: получение трансформирующей ячейки Ес L дополнительной ДНК (далее дДНК) с использованием многостадийной циклической экстракции РНК, кодирующей полипептид (далее мРНК).
Проба 2: получение олигонуклеотидов формулы
Т
3 — TTc ACCTAGTTg AAG GT-5
А кодирующих аминокислотную последовател ь ность формул ы
Lys Trp — Ife Asn — Phe — G1ï, 1727533 экспрессионных носителей, содержащих следующим образом.
1. Выделение и очистка водораствориМоА части Fc< R, 30
Человеческие лимфобластоидные клетки В, например, клетки RPM1 — 8866, выделяют на поверхности Ес. R с молекулярной массой приблизительно 46 кд и отдают фрагмент с молекулярной массой приблизи- 35 тельно 25 кд в надосадочную жидкость культуры. В результате проведения опыта с использованием связанного с энзимом иммуносорбента, выделяют два моноклональ40
4. Выделение генов, кодирующих человеческий рецептор Fcz малого сродства, из матрицы PHK лимфобластоидных клеток, продуцирующих мРНК рецептора Fcz, синтез дДНК с последующей идентификацией ген, кодирующий рецептор Ес, с использованием двух маркированных проб, содержащих специфичную к клеткам Fc R L дДНК и олигонуклеотид, общий с геном рецептора
Fc малого сродства, и репликацией полученного таким образом гена рецептора
Fc<, 5. Экспрессия дДНК Fc< R.
6. Определение гена, кодирующего человеческий рецептор Fcg с использованием дДНК, полученной из носителей согласно п. 5.
7, Экспрессия мРНК Fc R.
8. Получение вектора содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора Fc u его О-гликозилированных производных, а также экспрессия этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающихщих.
Описанные выше операции проводят ных антитела (далее именуется "метод эним"). Активность Ес R, выделяемая лимфобластоидными клетками RPM1 8866, выше в концентрированной надосадочной жидкости культуры, чем в солюбилизированных поверхностно-активным вещест.вом ПН вЂ” 40 мембранных рецепторах, хотя для получения Fc< R используют одинаковое количество, например, 10 клеток/мл.
Кроме того, после хроматографии очищенных надосадочных жидкостей на полиакрилатном геле с использованием додецилсульфата натрия и элюации из геля активности Fc< R обнаружена активность в областях 45 — 46 кд и 24 — 25 кд. При этом концентрированные надосадочные жидкости имеют более высокое содержание активности в области 25 кд, Поэтому в качестве источника рецептора используют бессывороточные надосадочные культуральные жидкости.
Очистку Fc R с молекулярной массой примерно 25 кд осуществляют в колонках, содержащих 10 мг/мл очищенного моноклонального антитела, связанного с сефарозными шариками, В результате последовательной адсорбции культуральной жидкости на связанной с альбумином сыворотки крупного рогатого скота сефарозе и на связанной с мышиным иммуноглобулином сефарозе получают 70 / первоначальной активности (без улучшения удельной активности). После предварительной адсорбции рецепторному материалу дают связываться с сефарозой в течение 4 — 16 ч, при этом общая активность продукта элюации уксусной кислотой уменьшается, но удельная активность повышается до 83 ед/мкг и чистота увеличивается в 190 раз, В результате дальнейшей очистки рецептора хроматографией на колонне С вЂ” 4 с обращенной фазой и использованием линейного градиента 0 — 65 ацетонитрила и 0,1 трифторуксусной кислоты удельная активность повышается до
1630 ед/мкг и чистота рецептора увеличивается в 3710 раз. Однако степень извлечения составляет только 33 / первоначального материала. Очистке подвергают и солюбилизированную поверхностно-активным веществом мембрану Fc< R, но получаемая при этом удельная активность значительно меньше, чем при использовании культуральной надосадочной жидкости. Степень извлечения зависит от применяемого для элюации буфера, т,е. при осуществлении элюации
2,5 -ной уксусной кислотой с последующей быстрой нейтрализацией выход рецептора можно значительно повышать.
Очистка Ес ° R с использованием моноклональных антител в твердой фазе является недостаточной для получения чистого рецептора. Поэтому после элюации Fc< R подвергают дальнейшей очистке при помощи жидкостной хроматографии с обращенной фазой. При этом свежеэлюированный материал подают на колонку С вЂ” 4 и подвергают хроматографии с использованием линейного градиента 0 — 65 ацетонитрила.
Fc< R элюируется ацетонитрилом при концентрации 44 — 45 .
Активность Fc< R, получаемая в результате жидкостной хроматографии на колонке
С вЂ” 4, показывает одну полосу, соответствующую материалу с молекулярной .массой 25 кд, который проявляеточень высокуюактивность при проведении анализа методом эним. Следует отметить, что полоса 25 кд соответствует меньшему виду Ес R, который обнаруживается теми же моноклональ1727533 орастворимои части Рс В.
1П
Me t- Gl u-Leu-Gl n-Ча 1-S e r -Se r -Gl y- Ph e-Va 1- (N-КОни в во 4,)
Gly-Glu-Phe-I1å-Trp-Ча1-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp Tyr-Ser-AsnTrp-Ala-Pro-Gly-Gl u-Pro-ThrLys-Hi s-Ala-Ser -Hi s-Thr -Gl y- Ser-Tr p- I le-Gly-Leu-Ar g-Asn-Le u "Р- " y - — 20
I I /у -.ф/д - ф/
30
40
50
55 ными антителами после поверхностной иодинации и иммуноосаждения Fc„. R c использованием тех же антител. Предполагается, что части с 46 и 25 кд являются антигенно идентичными, причем последняя представляет собой водорастворимую часть
Fc,. R.
2. Анализ частичных последовательностей вод
3. Получение проб гибридизации.
Проба 1 (дДНК, специфичная относительно L-клеток, положительных в отношении Fc R).
Клетки L, имеющие недостаток тимидин-киназы (далее ТК), например, клетки
LtK, подвергают трансфекции высокомолекулярной ДНК из клеток RPM1 — 8866 и ТК. геном из вируса Герпес-симплекс. После селекции НАТ ТК положительные трансформанты обрабатывают биотинированным анти — Fc< R антителом (8-30) и FITC-авидином и классифицируют. В результате получают две трансформированные клетками L линии, L V-8-30 и L-Vl 8-30.
PH К получают из клеток L — Ч-8-30 с использованием гуанидина изотиоцианата и хлорида цезия. ДНК, дополнительную к мРНК из клеток L — V — 8 — 30, синтезируют обратной транскриптазой на олиго/dT/ïðàéмере. дДНК путем введения маркированной альфа- P-деокси-СТР гибридизируют с 10г кратным избытком пол и/А/ — P HK. полученной из клеток LtK . Реакционную смесь нанбсят на колонку с оксиапатитом. Не связанную однонитевую дДНК подвергают повторной гибридизации с поли/А/ -PHK, полученной из клеток LtK, Первую нить дДНК, специфичную в отношении трансформантов клеток L, положительных относительно Fcz R, используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc< R в ламбда-gt-10-библиотеке.
Проба 2: синтез смеси олигонуклеотидов формулы
On ределя ют последовательность аминокислотных остатков в Рс В с использованием трипсина и лизилендопептидазы, При обработке трипсином получают 11 фрагментов, а при обработке лизилендопептидазой — 12 фрагментов. Получались следующие фрагменты:
° т А А
3-ТТс ACCTAGTTG AAG GT — 5
А
Этот огигонуклеотид используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc -реE цептора.
4. Выделение и идентификация сред, содержащих ген, кодирующий человеческий
FcFR малого сродства. мРНК выделяют из клеток RPM1 — 8866 путем центрифугирования в градиенте хлористого цезия, экстракции фенолом и осаждения этанолом. Поли/А/ -PHK выделяют хроматографией на олиго/dT/öåëëþëîçå.
Поли/А/ -PHK используют в качестве
+ матрицы для получения дДНК с помощью обратной транскриптазы и олиго/dT/ïðàéмера. После обработки RN азой Н вторую нитку ДНК синтезируют при помощи ДНК полимеразы 1. ДНК модифицируют при помощи Т4 — ДНК-полимеразы с тем, чтобы удалить остаток 3 -выступов из первой нити
ДНК и лигируют в EcoR1-линкере. дДНК длиной более 1000 п.о. фракционируют и избыток линкеров удаляют хроматографией на колонке. дДНК клонируют в ДНК лямбдаgt10 фага по сайту EcoR1 и трансформируют в штамм 0600 hfe Escherichia coil.
Гибридизацией колоний идентифицируют те, которые специфичны в отношении
Fc R, При этом используют указанные выше пробы.
Отбирают 23 из примерно 30000G клонов, которые гиоридизируются с обеими пробами.
1727533
5 10 15
Net Glu Glu Gly G1n Tyr Ser Glu 11е Glu Glu Leu Pro Arg Arg
ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG АТС GAG GAG СТТ ССС AQG AGG
ТАС CTC CTT ССА QTT ATA AQT СТС TAG СТС CTC GAA GGG TCC TCC
20 25 30
Arg Cys Сув Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly Leu Val
CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG CTG GTG
ОСС ACA ACG ТСС GCA ССС TGA GTC TAG САС GAC QAC ССС GAC C4C
35 40 45
Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp
АСС GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG TGG
TGG CGQ CGA GAC АСС CGA ССС SAC GAC TGA GAC GAA GAG GAC ACC
50 55 60
His Trp Asp Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala
CAC TGG GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT
GTG АСС CTG TGG TGT GTC ТСА GAT TTT GTC GAC CTT CTC TCC CGA
65 70 75
Ala Arg Asn Val Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser Hi s His
GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT ТСС AAG AAC TTG GAA АОС CAC CAC
CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG ТТС TTG AAC CTT TCG GTG QTG
-з г
80 85 90
Gly Asp Gln Met Ala G1n Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln
GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA ТСС CAG ТСС ACQ CAG ATT ТСА CAG
CCA CTG GTC TAC CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC
95 100 105
Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gln Qln Arg Leu Lys Ser Gln
GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG
CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC
110 115 120 Авр Ьеи Glu Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu
ОАС TTG GAG CTG TCC TGG ААС CTG AAC GGG CTT CAA QCA QAT
СТО AAC СТС GAC AGG АСС TTG GAC ТТО ССС QAA GTT CGT CTA QAC
5, Экспрессия дДНК для Fc R.
Вставку EcoR1, содержащую дДНК для
Fc» R и выделенную из описанного лямбда
gt10 клона, лигируют с переваренным
EcoR1 плазмидным вектором рСЕМ вЂ” 4, тм обозначенным LE392. Этот вектор содержит два промотора SP6 и Т7 в противоположной друг другу ориентации, дДНК для Fc,R можно сразу же транскрибировать в мРНК. дДНК переваривают BamH1 и полученную
ДНК применяют в качестве матрицы для синтеза мРНК при помощи SP6 PHK-полимеразы. Полученную PHK впрыскивают в ооциты Xenopus, После двухдневной инкубации ооциты лизируют и определяют наличие Fc< R методом эним с использованием двух анти-Рс Я антител 3 — 5 и 8 — 30, которые распознают различные эпитопы на Fc 5 направлениях. Сегмент ДНК между обоими S40 ранними промоторами удаляют гидролизом эндонуклеазой EcoR1 и заменяют на вставку дДНК pFc< R — 1/pDE2 — Fc< R — 1/. Клетки оз7 трансфецируют pDE2 — дДНК Fc< 10 R. Анализ показывает, что 307ь трансфецированных клеток подтверждает, что дДНК кодирует молекулу Fc: R, 6. Определение нуклеотидной последовательности дДНК для Ес В. 15 Полная нуклеотидная последовательность и связанная с ней последовательность аминокислотных остатков представлены ниже. При этом кодирующая последовательность имеет следующую фор20 мулу: 1727533 125 130 135 Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu Leu Asn Qlu Arg Asn Qlu Ala Ser AGC AGC TTC AAG TCC CAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA TCG TCG AAG AGG GTC AAC TTG TTG CTT CGA AGT 140 145 150 Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu G1u Чаl Thr Lys Leu Arg Met GAT TTG CTG GAA AGA CTC CGG GAG GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG CTA AAC GAC CTT TCT GAG GCC CTC CTC САС ТОТ ТТС GAT ТСС TAC 155 160 165 Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACQ TGC CCT GAA СТС AAC GTC САС AGG TCG ССО AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT 170 . 175 180 Lys Trp I1e Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Оlу Lys Gly AAG TQG ATC AAT ТТС CAA CGG AAG TGC ТАС TAC TTC GGC AAG GGC TTC АСС TAG ТТА AAG GTT GCC ТТС ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG 185 190 195 Thr Lys Q1n Trp Чаl His Ala Arg Tyr Аlа Cys Asp Asp Met Glu АСС AAG CAG TGG GTC CAC ОСС CQG ТАТ QCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG ТТС GTC ACC CAG GTG CGG QCC ATA CGG АСА CTG CTG TAC СТТ 200 205 210 Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Qlu Glu Gln Asp Phe Leu QGG CAG CTG GTC AQC ATC САС AGC CCQ GAG GAG CAG GAC TTC CTG ССС QTC GAC CAG TCQ TAG GTG TCG GGC СТС CTC GTC CTG AAG GAC 215 220 225 Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn ACC AAG CAT GCC AGC САС АСС GGC ТСС TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG ТТС QTA CGG TCG GTG TGQ CCG AQQ ACC TAA CCG GAA GCC ТТО 230 235 240 Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Азр Gly Ser His Val TTQ GAC CTG AAG GGA GAG ТТТ ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC ТТС CCT СТС AAA TAG .ACC САС CTA ССС TCG GTA САС 245 250 255 Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln GAC TAC AGC AAC TGQ QCT ССА GGG GAQ ССС АСС AGC CQG AGC CAG CTG ATG TCQ TTG ACC CGA GGT ССС CTC GQG TGG TCG GCC TCG GTC 260 265 270 Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg G1y Ser Gly Arg Trp Asn Asp GGC GAG QAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT СОС TGG AAC GAC CCG СТС CTG ACG САС ТАС ТАС GCC CCG AGG ССА GCG АСС TTG CTQ 275 280 285 Ala Phe Cys Asp,Arg .Lys Ьец Gly Аlа Тхр Чаl Суз Азр Arg Leu GCC ТТС TGC GAC CGT AAQ CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG АСС CAC ACG CTG GCC GAC 290 295 300 Ala Thr Cys Thr Pro Pro Аlа Ser Glu Qly Ser Ala Glu Ser Met ОСС ACA TGC ACG CCG ССА GCC AGC GAA GGT ТСС GCQ GAG TCC АТО CGG TQT ACG TGC GQC GGT СОО TCG СТТ ССА AGG CGC СТС A60 TAC 1727533 305 З1О 315 Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA ССТ GAT TCA AGA CCA 6АС CCT GAC GGC CQC CTG ССС АСС ССС CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GQA CTG CCG GCG GAC GGQ TGG GGG Ser Аlа Pro Leu His Бег TCT GCC ССТ СТС CAC ТСТ AGA CGG GGA GAG GTG AGA TGA ACT 15 25 Met ATG TAC G1u Leu Gln Чаl Ser $ег Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG ТСС AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC ААС GTC CAC AGG TCQ CCG AAA CAC ACG-TTG TGC ACG GGA CTT Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Сув Tyr Tyr Phe Qly Lys Gly AAG TQG ATC AAT ТТС CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG ТТС CCQ Thr Lys Gln Trp Чаl His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu АСС AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG ТТС GTC ACC CAG GTG CGQ GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAC CTT Gly Gln Leu Чаl Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln Asp Phe Leu GQQ CAG CTG GTC AGC ATC САС AGC CCG GAG GAG CAG GAC ТТС CTG ССС GTC GAC CAG TCG TAG GTQ TCG GGC СТС CTC GTC CTG AAG GAC Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn АСС AAG САТ GCC AGC CAC АСС GGC ТСС TGG ATT GQC CTT CQG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGQ ACC TAA CCG GAA GCC TTG Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Пе Trp Val Asp Gly Ser His Val TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TQG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT СТС AAA TAG ACC CAC CTA ССС TCG GTA САС Большое количество растворимого Рс и с молекулярной массой 25 кд обнаруживается в культуральной надосадочной жидкости клеток RPM1 — 8866. N-концевой аминокислотный остаток (Met) растворимого Fc 259, 273, 282 и 288), которые, вероятно, образуют дисульфидные связи и представляют собой структуру, устойчивую к воздействию п ротеолитических энзимов. Поэтому С-концевая область (150 — 321) соответствует растворимому Fc< R, который представляет собой продукт протеолитического расщепления связанного с мембраной Fc R. 7. Экспрессия мРНК для Fc„.R. Поли/А/ -PHK получают из клеток различного типа и анализируют на экспрессию мРНК для Fc R. Основную полосу длиной 1700 оснований обнаруживают в B лимфобластоидных клеточных линиях (RPM1 — 8866 и RPM1-1788), pre B клеточной линии FL Ф 8 — 2 и в двух трансформантах Fc< R L клетки. но не в клетках РСЕR . включающих две линии лимфомы, Т клеточной линии (СЕМ) и в трансформантах клетки, которых экспримируют другой В клеточный антиген (CD20). Кроме того, мРНК для Fc< R не обнаруживается в обычных Т клетках, тогда как обычные В клетки экспрессируют такое же количество мРНК для Fc< R, что и В лимфобластоидные линии. 8. Получение вектора, содержащего последовательность ДНК, кодирующую водорастворимый фрагмент рецептора Fc< R. Водорастворимая часть рецептора Fc 14 1727533 Asp Туг $ег Авп Тгр А1а Рго GAC TAC AGC AAC TGQ GCT ССА СТО ATG TCG TTQ ACC CGA GGT Gly GGG ССС Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln GAQ ССС ACC AGC CGG AGC CAG CTC GGG TGQ TCQ GCC TCG GTC Qly Glu Asp Cys Ual Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGQ GGC ТСС GGT CGC TGG ААС GAC ССО СТС CTG ACG CAC ТАС ТАС GCC CCG AGG ССА GCG АСС TTG CTQ Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GG AAG АСО CTG GCA ТТС GAC Ala Thr Cys Thr Pro Pro А1а QCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA CCT QAT TCA AGA ССА GAC CCT GAC GGC CGC CTG ССС АСС ССС ССТ GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC QGG TGG GGG Ser Ala Pro Leu His Ser ТСТ GCC CCT СТС САС TCT TGA AGA CGG GGA GAQ GTG AGA ACT 30 40 50 Включающая мембрану область Fc Такая сигнальная последовательность может применяться дополнительно и в положении перед дДН К, кодирующей водорастворимую часть. Получают новый рекомбинантный водорастворимый фрагмент, имеющий по крайней мере одно место О-гликозилирования, а также новые плазмиды, содержащие эти последовательности ДНК, и рзРс R-1. Получают последовательность дДНК, в которой дДНК по крайней мере для части аминокислот 1 — 148 франмента Fc R отсутствует, так что имеются только последовательность, кодирующая часть протеина мембраны, и часть, кодирующая водорастворимый фрагмент дДНК всего рецептора. Часть последовательности дДНК, кодирующей аминокислоты 1 — 148, заменена на подходящий фрагмент дДНК, кодирующий эукариотную сигнальную последовательностьь. EcoR1 BamH1 вставку дДНК BSF-2 длиной 1,2 т.п.о. получают путем переваривания pBSF — 2.38 с помощью llindlll и BamH1. Полученный фрагмент, содержащий всю дДНК BSF — 2, подвергают перевариванию с помощью Hinf1 и 3 -концы обрабатывают Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTQ CCG CQG ACC САС ACG CTG GCC GAC Ser Glu О1у Ser Ala Glu Ser Met AGC GAA GGT TCC GCQ QAG ТСС ATG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC фрагментом Кленова ДНК полимеразы. После переваривания с помощью Kpnl полученный фрагмент Kpnl-Hinf1 длиной 110 п,о„содержащий доминантную последовательность BSF-2, клонируют в pGEM4 после переваривания с помощью,Kpnl u SmaL Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pBSF2-L8. pBSF2 — L8 подвергают перевариванию с помощью BamH1 и 3 -концы обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы, Переваренную Hindlll и Pstl, дДНК Fc С целью сравнения биологической активности протеинов, полученных клонами pFc< R — 1, psFc< R-1, р Л NFc R-1 и рЛ NFc R-1 с помощью BamH1, а р Л NFc< R — 1 и р Л NFc R 2 — с помощью EcoR1. ПолученЕ ные фрагменты применялись в качестве матрицы для синтеза мРНК с использованием SP6 РНКполимеразы. Полученные мРНК впрыскивают в ооциты xenopus ieavis, После двухдневного инкубирования активность Fcq R в кутуральных надосадочных жидкостях и лизатах ооцитов определяют методом эним с использованием анти-Fc< R антител 3 — 5 и 8-30, которые распознают два различных эпитопа на FcsR. В лизатах PB u культуральной надосадочной жидкости 1 П/554 EBI-49б: 5 6ААСТОСАООТОАОСТСТ66ТТТСОТТТОСААСАСТТОСССООАААААТО Е BI-497 3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTÒÀÑÑTÀG 5 Sau3A с тем, чтобы восстановить соответствующие кодоны формул G l uL euG 1 n Va lSe rS e r GlyPhe 9h 1CysAsnThr Cys ProG1 uLys Try 5 ОААСТОСАООТОАОСТСТООТТТСОТТТОСААСАСТТОСССООАААААТО 3 3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5 Sau3A ооцитов, в которые впрыскивают транскрипты рГс Я вЂ” 1, р ЬИРс Я вЂ” 1 и р ЛNFc Водорастворимый фрагмент Fc< R из ооцитов проявляет способность к связыванию иммуноглобулина Е при помощи модифицированного метода эним, заключающегося в использовании анти-Fc< R-антител 3 — 5, иммуноглобулина Е и человеческого AP-антииммуноглобулина. При этом надосадочная жидкость ооцитов, в которые впрыскивали мРНК pSFc R — 1, инкубируют на покрытых антителом 3 — 5 пластинах, которые затем последовательно инкубируют с человеческим иммуноглобулином Е и AP-антииммуноглобулином Е. Выделившийся из ооцитов фрагмент Fc R образует комплекс с иммуноглобулином Е. В качестве контроля проводят связывание с нетрансформированной надосадочной жидкостью из ооцитов, буфером и надосадочной жидкостью из клеток RPM1 — 8866. Надосадочную жидкость ооцитов подвергают дальнейшему опыту по определению способности к торможению образования розеток между фиксированным ох РВС, покрытым человеческим иммуноглобулином Е, и клетками SKW6 — CL4, несущими Ес R на своей поверхности. Последовательность Fc< R экспрессировать под контролем промотора бактериофага Lambda/ÐL/. Чувствительный к температуре аллель этого репрессорного гена может включать вектор, который содержит полную последовательность Рс R. Если температуру повышают до 42 С, то репрессор инактивируется и промотор экспримируется на своем максимальном уровне. Могут применяться системы промотор— 1О оператор или их части, например арабинозный оператор, колицин-Е>-оператор, галактозный оператор, щелочной фосфатазный оператор, трп-оператор, кисксилозный Аоператор, tac-оператор и другие. Плазмиду pRH 100 переваривают с помощью Sstl. Затем 3 -выступы удаляют и линеаризованную плазмиду подвергают дефосфорилированию. После экстракции фенолом и хлороформом, электрофореза, электроэлюации и осаждения линеаризованный вектор лигируют со вставкой, получаемой следующим образом. Плазмиду pGEM4-Fc 392 с Hindlll и повторного введения в 25 pGEM4длинного фрагмента EcoR1 и Hindi ll, переваривают с EcoR1 и Hindlll. Затем выступающие 5 -концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДН К-пол имеразы 1, после чего 5 -фосфатные группы удаляют, После ЗО очистки полученный фрагмент гидролизуют Sau ЗА и больший фрагмент выделяют, Так как в результате этой операции удаляют не только 5 -область, но и нуклеотиды для первых N-концевых аминокислот водорастворимой части, синтезируют два олигодеоксинуклео35 тида формул зом Название Последовательность NF 1 тсалаССТСЛТАТСЛАтаАОАТТСССАТСТАТТТТСАСТОСТатТТТатт (50- GGC (53-меГ ) NF Э CGCTG TTCCTCCÎCÒTTÎÎCTÑCTCCËGÒÑAACACTÀCTÀÑTÎÀËÉÀCG 3NACTGCTC TTC GCT (70-МЕр) 17 (без кодона ATG, так как он содержится в промоторно-операторно-линкерной системе плазмиды pER103). Вставки лигируют с линеаризованным вектором ДНК и трансформируют в Е.coli НВ101, отбирают устойчивые к ампициллину колонии. Плазмиды исследуют путем рестрикционного анализа. Плазмиду отбирают и обозначают как рРН 246. Дополнительно к прокариотам могут применяться дрожжевые культуры. Гены водорастворимой части человеческого рецептора Fc 321 можно экспрессировать в дрожжах, если применять ADH1-промотор вместе с ADH1терминатором. Дрожжевой экспрессионный вектор можно получать за счет получения: а) плазмиды, содержащей дрожжевой AD H1-терминатор; б) плазмиды, содержащей дрожжевой ADH1-промотор и дрожжевой ADH1-терминатор; в) плазмиды, содержащей дрожжевой ADH1-промотор, ген, кодирующий дрожжевую доминантную последовательность MF а, мультиклонирующее место и дрожжевой ADH1-терминатор; г) плазмиды, содержащей ADH1-промотор, последовательность, кодирующего водорастворимую часть человеческого рецептора Fc,. R малого сродства, и ADH1-терминатор; д) трансформации полученной плазмидной ДНК в дрожжевом векторе. При этом получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету без доминантной последовательности MF a, и плазмиду, содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MF а . Операции проводятся следующим обраа) АОН1-терминатор выделяют из плазмиды pl014. ADH1-терминатор субклонируют в плазмиде pUC18 по сайтам Hindlll u 1727533 18 SphI и получают плазмиду pWS 214$4. По1 сле гидролиза pws 214S4 рестриктазами Sphl и ЯаП меньший фрагмент выделяют злектрофорезом в агарозном геле. 5 Фрагмент, содержащий ADH1-терминатор, подвергают лигированию с векторной ДН К, полученной перевариванием BluescrIbe M13 рестриктазами Sall u Sphl c последующей очисткой электрофорезом в 10 агарозном геле. Лигированную ДНК трансформируют в Е.coli IM101 и отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Плазмиду этих колоний обозначают как pRH241. Эта плазмида содержит имеющий примерно 340 п.о. фрагмент с ADH1-терминатором. б) ADH1-промотор выделяют из плазмиды pY-IDB-HulFN-омега-1, т.е. плазмиды для получения человеческого интерферона 2О омега 1. Плазмиду переваривают рестриктазой Sphl, затем удаляют 3 -выступ с использованием ДНК полимеразы 1 в присутствии dGTP и повторно гидролизуют рестриктазой Xho1, Электрофорезом в агарозном геле выделяют фрагмент размером 400 п.о. и подвергают его легированию с адапторной парой формулы ЕВ1-410: 5 AATTGGAAGGATC 3 Е В1 — 429: 3 CCTTCCTAG-р 5 B липкий конец лигируют с адапторной парой формулы E B1 — 418: 5 р TCGAGCACGTGGTAC 3 ЕВ1 — 424: 3 CGTGCAC 5 Реакции лигирования проводят одновременно. После очистки электрофорезом в агарозном геле ДНК лигируют с ДНК плазмиды pRH241 по сайтам EcoR1 и Крп1 и трансформируют ее в Е.coli. Колонии исследуют на наличие плазмиды с правильной конструкцией, которую обозначают как pRH242. 4g B) Химический синтез пептида MFa осуществляют с использованием предварительно синтезированных олигонуклеотидов: 19 1727533 20 CAGCTTCA6CTGGAAТТТОА6САОТТТС6ТСТТСЛОТЛОТА6Т6ТТОЛСТ ООАОСАОССЭЛХОСО АООА (lo-мер ) МР 4 ОААОСТОТСА1 СООТТАСТСТОАСЧ ТООААООТОАС ITCGACGYTG CT (4я -мец MF 6 GСЛЛАЛСАОСААСОТСОАЛОТСЛССТТССРАОТСАОЛОТЛЛССОЛТОА (4p -ме.,) MF 7 GTTTTCÑÑAÒÒÑTÑÑËËÑÒÑCËÑTËAÑËËÑGGÒÒTGTTGÒÒCAÒÒAËÑ АСТАСТАТТОСАТСОРТТОСТ (69-мер ) МГ 8 ССТТАОСАОСААТСОАТОСААТАОТАОТОТТААТ6ААСААСАААСС6ТТ6 TTAGTGGAGTTGGAGAATG (6%мер ) MF 9 ОСТЛРООЛАОААООТGTTTCTTT GACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49 -gegj МГ 10 СТАОАОАЛТТССТОСЛОАООССТСТТСТССАААОАААСАССТТСТТ (46-МЕр) EBI-491: 5 TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC АСТ TGT CCA GAA AAG TG EBI-495: 3 CGAGTATATGTTACC ТАС CTT AAC GTT CAA AGG AGA ССА AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT СТТ ТТС ACC TAG 1 (ЯаоЗА Олигонуклеотиды MF2 — MF9 подвергают фосфорилированию. После прекращения реакции путем нагревания получают следующие смеси: MF1 и МРг; M F3 и MF4; MF5 и MF6; MF7 и MF8; MF9 и MF10. После нагревания и охлаждения пять растворов объединяют и лигируют. К полученному раствору добавляют линеаризованную ДНК плазмиды pRH 242, полученную путем переваривания с помощью Xho1 и ХЬа1 и последующей очистке электрофорезом. Раствор лигируют и трансформируют в Е.coll IM101, Плазмиды полученных колоний исследуют путем переваривания с помощью Xho1 и ХЬа1. При этом те плазмиды, которые содержат вставку длиной примерно 290 п,о. клонируют с М13мр8 с последующим анализом последовательностей. Плазмиду, содержаI щую правильную вставку, отбирают и обоз30 начают как pRH243. r) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc< R малого сродства, выделяют из плазмиды pGEM4 путем переваривания с помощью Hindlll и EcoR1 и липкие концы дополняют с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из Е.coll. Большой фрагмент подвергают фефосфорилированию и очистке, а затем гидролизуют с помощью Sau3A. Так как при этом удаляется нетолько 5 -область, но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, начиная с аминокислоты 150, синтезируют два олгинодеоксинуклеотида 21 1727533 22 с тем, чтобы восстановить полный ген с ис- пользованием дрожжевого кодона формулы Met 5 TCGAGCTCATATACA ATG 3 CGAGTATATGT TAC XhoI 155 160 1б5 Glu Leu G1n Val $ек Ser Gly Phe Ча1 Cys Asn Thr Cys. Pro Glu GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT ТТС GTT TGT AAC АСТ TGT CCA GAA СТТ AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA ACA GGT CTT Lys Trp AAG TG ТТС АСС TAG Sau3A EBl-430: 5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT ТТС GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG EBI-437: 3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG ТАС CTT AAC GTT CAA AGG AGA ССА AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT CTT TTC АСС TAG 5 Sau3A l с тем, чтобы восстановить полный ген с использованием дрожжевого кодона формулы Met 5 ATG 3 TAC GIu Leu Gln Ual $ег Ser Gly Phe Val Cys.Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT CTT Полученные олигонуклеотиды ренатурируют и лигируют с фрагментом Sau3A и EcoRf c использованием лигазы Т4 ДНК. Вставку лигируют ДНК, плазмиды pRH242 по сайтам Xba1 и Xho1 и трансформируют в Е.coll!М101. Плазмиды полученных колоний исследуют при помощи рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH244. д) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc R малого сродства, выделяют из I плазмиды pGEM4-Рс R путем переваривания с помощью Hindi ll ЕсоЮ и концы дополняют с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 из E.coll. Меньший фрагмент подвергают дефосфорилированию и очистке, Так как Kindlll режет дДНК Fc< R примерно 50 п.о. после первой аминокислоты, 30 вставку подвергают гидролизу с помощью Sau3A. Так как при этом удаляют не только 5 -область (в направлении конца). но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водо растворимого фрагмента, синтезируют два олигонуклеотида формул Lys Тгр AAG TG TTC ACC TAG Sau3A Олигонуклеотиды ренатурируют, фрагмент Sau3A и ЕсоЯ1 добавляют и подвергают лигированию с помощью ДН К лигазы Т4. Полученный фрагмент подвергают очистке путем электрофореза, электроэлюции и осаждения известными методами. Вставку лигируют с ДНК плазмиды pRH243 по сайтам Есор, и Stul и трансформируют в Е.coll IM101. Полученные колинии исследуют с помощью рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH245. е) Плазмиды pRH244 и pRH245, состоящие из промотора ADH1, доминантного гена IVIFa (только в случае pPH245), водорастворимого гена Fc„. R и терминатора ADH1, гидролизуют рестрйктазами Hiodlll u BamH1 и лигируют с дрожжевой плазмидой plDB207 или УЕр13. Плазмиду LE392 или pGEM4 (рЕс- R — 1) переваривают при помощи Hindlll и EcoR1. Фрагмент ДНК, начинающийся с нуклеотида 584, клонируют в плазмиду pGEM4, по сайтам Hindlll и EcoR1. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как рANFc R-1. Плазмиду LE392 или pGEM4 (рРс R-1) гидролизуют с помощью EcoR1 и получают фрагмент, содержащий дДНК длиной примерно 1,7 т.п.о (Fc R). Полученный фрагмент частично переваривают с помощью Sau3A с тем, чтобы удалить последовательность дДНК, кодирующую цитоплазменный домен, например, для аминокислот 1 — 23, и фрагмента дДНК, начинающего с нуклеотида 254, лигируют с 26-мерным линкером формулы 5 — GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA — 3 с тем, чтобы восстановить стартовый кодон АТС на 5-конце и рестрикционное место Крп1. Лигированный фрагмент клонируют в плазмиду pGEM4 по сайтам Крп1 и EcoR1. Путем гибридизации отбирают клоны, у которых область предположительного цитоплазменного домена отсутствует. Один клон отбирают, размножают и обозначают как р Л NFc R — 2. Общие материалы и методы. Моноклональные анти-Fc 5 (g> ) и 8-30 (,и ) получались путем гибри- 1727533 24 дизации P3U1 миеломы с клетками мышиной селезенки, иммунизированными клетками RPM1-8866. Антитело 8 — 30 распознает эпитоп, смежный с местом связывания иммуноглобулина рецептора Fc, и может блокировать связывание иммуйоглобулина с лимфобластоидными клетками 8866. Антитело 3 — 5 распознает другой эпи1О топ íà Fc R и не может эффективно блокировать связывание иммуноглобулина с его рецепторами, Эти антитела осаждают в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях полипептиды с молекулярной массой 46 кд и 25 кд. Моноклональные антитела очищают путем осаждения 50 -ным насыщенным сульфатом аммония и последующей гелевой фильтрации с использованием сефарозы 6В (в случае иммуноглобулина М) или ионнообменной хроматографии с использованием сефадекса (в случае иммуноглобулина С1). Поликлониальный мышиный 55 иммуноглобулин G выделяют таким же образом. Предварительно очищенный материал Fc< R подают на колонку, уравновешенную водой, содержащей 0,1 трифторуксусной кислоты, и элюированную линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1 о трифторуксусной кислоты. При этом ацетонитрил применяют в количестве 0,5 мл/мин с соблюдением линейного градиента от 0 до 65о в течение 60 мин. Элюированный материал замораживают и лиофилизируют перед исследованием на активность методом эним. Синтезированные олигодеоксинуклеотиды очищают путем электрофореза на полиакриламидном геле. Пример А. Получение плазмиды pY— i D B-Hu I F N-омега1. а) Получение дрожжевого промотора АОН1. 8 мкг плазмиды pES103 переваривают с BamH1 и Xho1 в 500 мкл раствора. Промотор длиной около 1450 п.о. отделяют в 1 -ном агаровом геле и осаждают. Фрагмент суспендируют в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (далее ЭДТУ), рН 8). Плазмиду pES103 получают за счет введения в pUC18 переваренной BamH1 и Xho1 плазмиды AX 11 длиной около 1450 п.о. б) Подготовка вектора pIDB207. 10 мкг plDB207 линеаризуют при помощи BamH1, С целью предотвращения последующего повторного связывания удаляют 5 -концевые фосфатные группы путем обра- ботки фосфатазой кишечника теленка. Линейную форму отделяют в 1 -ном агаровом 25 геле от неразрезанной плазмиды. Полученный вектор ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера, в) Экспрессионный вектор для интерферона типа омега 1. 50 мкл плазмиды pRHW12 линеаризируют при помощи Hindi ll, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и очищают путем электрофореза в агаровом геле. Для получения соединяющихся с промотором концов к концам линейного pRHW12 присоединяют линкер Xho1. Путем обработки 100 единицами. Xho1 освобождают специфические относительно Xho1 клейкие 5 -выступы. Снабженный Xho1-концами линейный pRHW12 очищают путем электрофореза в агаровом геле, добавляют 5 мкл промотора (со стадии "а"), лигируют и осаждают. ДИК суспендируют и режут при помощи BamH1. ДНК получают очисткой в агаровом геле. r) Лигирование фрагментов. Готовый экспрессионный вектор hollучают лигированием фрагмента BamH1 (промотор и ген интерферона типа омега 1) с вектором pIDB207. д) Трансформация. Клетки Е.coli НВ101 трансформируют путем добавления раствора лигированной ДНК и культивируют на LB-агаровых пластинках; содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Выбирают 12 из полученных клонов и выделяют содержащиеся в них плазмиды. После анализа плазмид при помощи рестрикционного анализа и электрофореза в агаровом геле отбирают плазмиду, имеющую правильную конструкцию. Ее обозначают как pY-IDB — HulFN-омега 1. Пример Б. Конструкция экспрессионной плазмиды pRH100. ДНК плазмиды pER103 расщепляют эндонуклеазой Hindlll, 5-концевые фосфатные остатки удаляют щелочной фосфатазой кишечника теленка (ФТК). ДНК осаждают дабавлением 0,1 об раствора ЗМ ацетата натрия с рН 5,5 и этанола. Осадок ДНК центрифугируют и промывают 70 -ным раствором этанола. Си нтетические олигонуклеотиды o(AGCTTAAGATGAGCT) и о(САТСТТТА) фосфорилируют Т4-полинуклеотидкинаэой (П Н К). Раствор плазмиды и фосфорилованного олигонуклеотида перемешивают и нагревают до 70 С в течение 5 мин, затем охлаждают до 0 С и добавляют буфер лигирования (500 мМ трис, рН 7,5), 100 мМ хлорида магния, 200 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 1 мМ у АТР, 500 мкгlмл альбумина сыворотки 1727533 26 крупного рогатого скота (АСС), Т4-ДНК лигазу. Реакцию проводят при 4 С в течение 40 ч. Ее прекращают путем нагревания при 70 С в течение 10 мин. Продукт лигирования переваривают эндонуклеазой SaC1, затем лигируют и подвергают трансфекции в клетки Е.соИ НВ101. Бактерии наносят на LB агаровые плитки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина. 12 из бактериальных колоний произвольно выбирают, выделяют плазмиды и режут эндонуклеазой SaC1. Наличие линейной молекулы ДНК l5 длиной 4400 п.о. подтверждает, что место распознавания SaC1 было встроено в плазмиду, Одну из плазмид произвольно выбирают. Плазмиду. обозначенную как pRH100, расщепляют эндонуклеазами EcoR1 и BamH1, разделяют в 1 агарового геля и меньший фрагмент выделяют из геля, Этот EcoR1-BamH1 фрагмент ДНК длиной примерно 460 п.о, подвергают анализу. Пример В. Конструкция плазмиды p h,NFc 2S ДН К рЕся-1 переваривают с помощью Hlndlll в 50 мкл и затем с помощью EcoR1. Получают фрагмент EcoR1-Hindill, содержащий область длиной 1 т,п.о. растворимого дДНК Fc< R. Переваренную ДНК подвергают Зп электрофорезу в 1 -ном агаровом геле, вы- . деляют Hindlll-EcoR1 фрагменты путем электроэлюации с последующим осаждением в 70 -ном этаноле. PGEM4 переваривают с помощью Hlndlll и EcoR1, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты лигируют и подвергают трансфекции в Е.coll (МС1065). Один клон отбирают, размножают и обозначают как р ЛNFc R-1. Пример Г. Конструкция плазмиды p h, NFc EcoR1, подвергают электрофорезу в агаровом геле (1 ). EcoR1 фрагмент длиной примерно 1,7 т.п,о. выделяют электроэлюацией с последующим осаждением этанолом при— 45 80 С в течение 1 ч. ФрагмЕнт переваривают рестриктазой Асс1 и частично рестриктазой Sau3A с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом с получением Sau3A — EcoR1 фрагмента. ДНК фрагмент щ подвергают лигированию с синтетическим линкером (5 -GATCTGAGTCATGGTACC— ATGACTCAGATCGTGCTG-3 ). ДН К экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты растворяют, переваривают рестриктазой Крп1 и экстрагируют фенолом с последующим осаждением этанолом. Избыточный линкер удаляют хроматографией в геле (биогел А 50 м), pGEM 4 переваривают 27 рестриктазой Крп1, затем EcoR1. Фрагменты, связанные с синтетическими лин керами, подвергают лигированию с Крп1 и EcoR1 фрагментом pGEM4 и осуществляют трансфекцию в Е.coll (МС1065). Клон р Ь ЙРс R 2, у которого отсутствует только цитоплазменный домен, выделяют и размножают с использованием известного метода гибридизации колоний. П ример1. а) Выделение сырого Fc< R из культуральной надосадочной жидкости. Клетки RPM1 — 8866 культивируют в среде RPM1 — 1640, содержащей еще 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при плотности 1х10 клеток/мл и жизнеспособности клеток 95 — 99 . Клетки собирают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, промывают три раза раствором Хенка ББС и культивируют в бессывороточной среде в течение 48 ч при той же плотности. Культуральную надосадочную жидкость собирают и добавляют 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 0,02 азида натрия и 200 ед/мл апротеина. Культуральные надосадочные жидкости хранят при 4 С во время концентрирования, которое осуществляют фильтрацией. Затем концентрированный в 200-300 раз материал центрифугируют с тем, чтобы удалить нерастворимый материал, Получают при этом сырой Ес R. б) Выделение Fc R из клеточных лизатов. Клетки RPM1 — 8866 (2х10 клеток) промывают четыре раза буфером PBC (содержит 0,5 поверхностно-активного вещества НП-40) и лизируют в 10 мл буфера лизиса и 1 мМ ФМСФ в течение 45 мин во льду при периодическом перемешивании. Дополнительно добавляют еще 10 мл буфера лизиса и реакцию продолжают во льду в течение 30 мин. Лизат центрифугируют при 37000 об/мин.в течение 45 мин при 4 С. Липидный слой тщательно собирают, надосадочную жидкость собирают и хранят при †70. Пример 2. Иммуноочистка. Концентрат кул ьтурал ь ной надосадоч ной жидкости (см. пример 1а), эквивалентный 510 л культуры, подвергают последовательной адсорбции на 2 мл сефарозного геля, связанного с альбумином сыворотки крупного рогатого скота, связанного с человеческим трансферрином сефарозного геля и связанного с мышиным иммуноглобулином сефарозного геля, каждый раз в течение 1 ч при j о 4 С. Вытекающий поток, собираемый с последнего геля, затем подают на 2 мл анти1727533 28 Fc, R (3-5), связанного с сефарозой. Иммуноадсорбцию проводят в течение 4-16 о ч при 4 С. Гель подают в колонку, вытекаю5 щий поток собирают и гель последовательно промывают 150 мл буфера А (10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 0,5 М хлорида натрия, 0,5 / НП-40), 150 мл буфера Б (10 MM трисHCI, рН 7,5, 0,1 НП-40), 150 мл буфера В (10 мМ трис-HCI, рН 7,5), элюируют 25 мл 2,5 об./ уксусной кислоты и сразу же нейтрализуют в 2 М трис-HCI с рХ 8,0. Полученный материал хранят при — 80 С, если он не подвергается непосредственной очистке путем 15 жидкостной хроматографии. Затем элюат фракционируют путем жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке С4 с использованием линейного градиента 0-65 ацетонитрила, содержащего 0,1 20 трифторуксусной кислоты. Пример 3. Анализ с использованием связанного с энзимом иммуносорбента (метод эним). Активность Рс и измеряют за счет определения его способности к связыванию с 25 моноклональными антителами 3-5 и 8 — 30, На микротитровальные пластинки сначала наносят 100 мкл на пробу моноклонального антителя 3 — 5 (в бикарбонатном буфере) 0,1 М бикарбоната натрия, рН 9,6, после чего 3{) инкубируют в течение ночи при 4 С, промывают четыре раза фосфатным буфером, содержащим 0,05 твина 20, с последующим добавлением .100 мкл исследуемого образца, разбавленного буфером с рН 8,1 (0,05 М трис-HCI, 1 мМ хлорида магния, 0,15 М хлоЗ5 риданатрия,0,05об, твин20,0,02/ азида натрия и 1 АСС). Микротитровальные платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают. Добавляют 100 мкл предварительно титрованного и разбав40 ленного конъюгата из козьего -анати-мышиного иммуноглобулина М и щелочной фосфатазы. Платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают, добавляют 100 мкл субстратного буфера { (0,05 M бикарбоната натрия, рН 9,8, 10 мМ гексагидрата хлорида магния), содержащего 1 мгlмл и-фенилфосфата динатрия, и колориметрируют каждые 30 мин в течение 2 ч при 405 и 620 нм. Пример 4. Гидролиз рецептора Fc R С при помощи лизилендопептидазы и отделение пептидов. Очищенный Fc< R переваривают с rioмощью лизилендопептидазы Achromobacter lytIcus в 50 мМ буфера трис-HCI с рН 9,5 при получают путем хроматографии на олигоdT-целлюлозе. Радиомаркированную дДНК синтезируют из поли/А/ -PHK с использованием P-dCTT. Маркированную дДНК 30 1727533 15 Net-Glu-.Ьеu-Gln-Ча1-Ser-Ser G1ó-Phe-Va1-, Gly- lu-Phe-I le-Trp-Val-Asp-Gl y-Ser-Hi s-Val-Asp-Tyr-Ser-AsnTrp-Ala- Pro-Glу-Glu-Pro-Thr-, Lys-His-Ala-Ser-Hi s-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Агу-Asn-LeuAsp-Leu-LysLys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-. Пример 5. Получение олигонуклеоти- 30 ца формулы 3 --ТТ ACC TAG ТТ ЛЛ GT -5 сушат. Выход: 285 мкг (оптическая плотность 260:7,7), Пример 6. Установление 1=клеточных трансформантов Рс R+ Один миллион клеток LtK подвергают трансфекции 150 нг вируса Герпес симплекс из tK гена и 20 мкг высокомолекулярной геномной ДНК из клеток RPM1 — 8866. После хранения в НАТ среде в течение 10 дней отбирают клетки. Клетки!, которые проявляют устойчивость к НАТ, собирают, травят биотинированным анти-Fc,.R (8-30) и авидином, связанным с изотиоцианатом флуоресцеина (ИТСФ), и классифицируют. проводят несколько циклов классификации для каждой трансфекции. В независимых трансфекциях получают две трансформантные линии: 1.-V-80-30 и 1 -V1-8-30, Пример 7. Клонирование дДНК Fc R Проба 1. Р Н К выделяют из трансформанта L-V-830 известным методом с использованием гуанидина и хлорида цезия. Поли/А/ -PHK 35 С в течение 6 ч при весовом соотношении энзима к субстрату, равном 1:500, Лиофилизованные пептидные фрагменты. очищают жидкостной хроматографией. Отделение пептидов жидкостной хроматографией с обращенной фазой. Отделение пептидов осуществляют посредством жидкостной хроматографии на колонке С4. Элюацию пептидов осуществляют с соблюдением следующих условий: линейный градиент смеси 2-пропанола.и ацетонитрила в объемном соотношении 7:3 в пределах от 0 до 35 в течение 1 ч в 0,1 трифторуксусной кислоты, расход 1,0 Олигонуклеотид синтезируют с использованием синтезатора А 1, деметилируют смесью тиофенола, триэтиламина и диоксана в соотношении 1:2:2 при комнатной тем- 40 пературе в течение 90 мин и промывают метанолом (10х1 мл метанола). После очистки деметилированного олигонуклеотида на пористом стекле и снятия защитной группы концентрированным аммиаком при комнатной температуры в течение 1 ч и при темпе- ратуре 550С в течение 16 ч осуществляют сушку продукта, Дальнейшую очистку осуществляют с 20 акриламидным гелем в присутствии 8 М мочевины, с элюацией ТБЕ-буфером (10,9 r три(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты и 9,3 r динатриевой соли этилендинитрило-тетрауксусной кислоты в 1 л). Электрофорез проводят в геле (40x25x0,01 см) при 50 Вт, Полосу 17-мер вырезают, элюируют водой и обессоливают на колонке с сефадексом С 25 с водой. Фракции, содержащие 17-мер, собирают и мл/мин, Фракционированные пептиды собирают путем определения абсорбции при 215 нм. Определение аминокислотных остатков и их последовательности. Анализы проводят после осуществления гидролиза пептидных фрагментов в 5,7 Н CI при 1100С в течение 22-24 ч в эвакуированных закрытых трубках. Аминокислоты фен илтис гида нтои на (ФТГ) on редел яют жидкостной хроматографией с обращенной фазой. Определяют следующие аминокислотн ые последовательности: 1727533 32 гидрогенфосфата натрия 0 5 мМ хлорида магния и 0,7 мМ хлорида кальция, и 500 мкг декстрана, снабженного диэтиламиноэтильными группами. После часовой инкуба5 ции при 37 С раствор заменяют ДМЭМ, о содержащего 10 FCS и 150 мМ хлороквина, инкубируют при 37 С в течение 3 ч и затем заменяют свежим ДМЭМ, содержа1О щим 10 FCS, Через 48 ч клетки обрабатывают связанным с фикоцианином анти-РсЯ антителом (3 — 5) и биотинированным иммуноглобулином Е, проявляют при помощи ИТСФ-авидина и подвергают анализу, Пример 9. Определение нуклеотидной 15 последовательности дДНК Fc R. Вставку рРс ° R-1 переваривают энзимами Hindlll u Pvull. ДНК субклонируют в М13 и подвергают анализу. 31 подвергают ренатурации избыточной поли/А/-PHK нетрансформированных LtK клеток и подают на оксиапатит колонку. Однонитевую с дДНК собирают и используют в качестве пробы 1. Проба 2, Олигонуклеотиды 17-мер, дополнительные к мРНК последовательности, кодирующей аминокислотный фрагмент Lys-Trp — Ие-Asn-Phe — Gin, и содержащие смесь 24 возможных последовательностей, радиомаркируют у P-ATP при помощи Т4-полинуклеотид-киназы, Двухнитевую дДНК синтезируют из поли/А/ -PHK, полученной из клеток RPM1 — 8866. После обработки метилазой EcoR1 и полимеразой ДНК Т4 двухнитевую дДНК длиной более 1000 п.о. клонируют в EcoR1 место лямбда gt10 с использованием EcoR1-линкеров. Приготовляют два набора реплика-фильтров из фага. Один набор фильтров подвергают гибридизации с P-маркированными олигоз нуклеотидами 17-мер (проба 2), Другой набор фильтров подвергают гибридизации с P-маркированной дДНК, специфичной 32 относительно Fc,R положительных клеток L (проба 1), при 68 С в течение ночи в 6xSSC i,1xSSC:0,15 М хлорида натрия, 0,015 М цитрата тринатрия, рН 7,0), после чего промывают 0,1х$ЯС и 0,1 додецилсульфата натрия. Пятна, которые гибридизируют с обеими пробами, выделяют. Пример 8. Экспрессия дДНК Ес;Я. Для экспрессии дДНК Fc< R в pGEM4 с использованием промотора SP6 мРНК синтезируют с помощью SP6 РНК полимеразы с использованием в качестве матрицы переваренного BamH1 рРс R-1. 10 нг мРНК впрыскивают в один ооцит, в качестве контрольного опыта аналогично получают мышиную BSF-1 мРНК, которую впрыскивают в другой ооцит. После инкубации в течение 2 дней в среде Барта при 20 С ооциты подвергают лизису в 50 мкл буфера лизиса (10 мМ трис-HCE рН 7,5, 0,5 M хлорида натрия, 0,5 НП вЂ” 40). Лизаты ооцитов исследуют на активность FCC R с использованием метода эним, в котором используют два анти-Fc R антитела (3-5 и 8 — 30). В качестве контрольного опыта используют концентрированную надосадочную жидкость, полученную из клеток R P M1 — 8866. Для экспрессии дДНК Fc< R в клетках 1. оз-7 вставку pFc R — 1 клонируют в EcoR1 место вектора pDE2. 5х10 клеток Cos-7 наносят на 60 мм плитки за день до трансфекции, которую проводят с использованием 2 мкг плазмидной ДН К в 1 мл буфера, состоящего из 25 мМ трис-HCf (рН 7,5), 137 MM хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 0,6 мМ Ю1 Пример 10. Анализ мРНК Рс R. Поли/А/ -РНКиз различных клеток разделяют в агаровом геле (1 ), подают на нитроцеллюлозную бугаму и гибридизуют со 25 вставкой pFc„R — 1, меченной в ник-трансляции. Для индукции BSF-1, 100 миллионов клеток В или Т культивируют в отсутствии или в присутствии 10 мкг/мл иммуноглобулина Е и 50 мкгlмл рекомбинантного человеческого BSF-1 10 мкг всей PHK ЗО экстрагируют и анализируют. Пример 11. Экспрессия водорастворимой части человеческого рецептора Fc< малого сродства в дрожжах, Стадия 1. Получение плазмид PjDB-244 и pjDB-245. а) Получение плазмиды pRH 241, содержащей дрожжевой ADH1 терминатор. 4g Получение вектора. 10 мкг Bluescribe М13+ подвергают двойному перевариванию с 20 единицами Зад и 20 единицами Sphl. Реакцию прекращают путем добавления 1/25 объема 0,5 М динатриевой соли этилендинитрилотетрауксусной кислоты и нагревания при 7 С в течение 10 мин. Разрезанный вектор очищает путем электрофореза на агаровом геле (1% агарозы, 1хТВЕ-буфер, состоящий из 6,05 г/л трис-оксиметиламинометана, 3,1 г/л борной кислоты, 0,37 г/л ЭДТА и содержащий 0,5 мкг/мл бромида этидия при 4, в/см). После обнаружения полосы ДНК с использованием ультрафиолетового света (254 нм) ДНК выделяют электроэлюацией с использованием бумаги ДЕ81 и очищают осаждением этанолом. ДНК растворяют в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис. рН 8,0, 1 мМ Э-ДТА). 1727533 Название MF 1 TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGÒÒ (50 -ЫФР) MF 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGAÒÀÒ6À GGC (53 -Mep) MF 3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGÀÑG АААСТ6СТСАААТТССА6СТ (70 -мер) NF 4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGÀÑÒ GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (70- eP) МР S GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCÒ (48 - чер) Получение вставки. 10 мкг pWS214 4 переваривают 20 единицами Sphl и 20 единицами Sal .1. Меньший фрагмент, содержащий ADH1-терминатор, выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения. Полученную ДНК растворяют в 10 мкл ТЕ-буфера. 1 мкл векторной ДНК и 1 мкл вставки ДНК лигируют ТУ-ДНК лигазой в 10 мкл раствора. 3 мкл лигазной смеси используют для трансформации Е.coll IM101 SupE, thl, del/lac-proAB/, F ftraD36, proAB, facfg, lacZ -del M15), лямбда-минус). После селекции ампициллином плазмиды выделяют и переваривают с помощью Sphl и $аО, Фрагменты разделяют в агаровом геле. Одну из плазмид отбирают и обозначают как pRH 241, б) Получение плазмиды pRH 242, содержащей дрожжевой ADH1-промотор и дрожжевой ADH1- терминатор. Получение вектора, Плазмиду pRH 241 подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Крп1. Меньший фрагмент удаляют из векторной части путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения, Полученный фрагмент растворяют в ТЕ-буфере. Получение вставки. Плазмиды pV-jDB-Hu-)ЕМ-омега 1 (CM. пример А) разрезают рестриктазой Sph1, 3 конец удаляют ДНК полимеразой 1 Е.coll в присутствии dGTP. ДНК гидролизуют Xho1, фрагменты выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения, Тупой конец фрагмента длиной 400 п.о., содержащий ADH1-промотор, подвергают лигированию с адапторной парой EB1 — 410: 5 ATTGGAAGGATC 3 Е В1 — 429: 3 CCTTCCTAG-P 5 . Липкий конец фрагмента видоизменяют с использованием адапторной пары ЕВ1 — 418: 5 р TCGAGCACGTGGTAC 3 Е В1 — 424: CGTGCAC 5 После одновременного лигирования обоих адаптеров фрагмент, содержащий ADH1-промотор, очищают электрофорезом в агаровом геле. Вектор и вставки лигируют, в результате лигирования вставки в вектор места EcoR1 и Крп1 разрушаются, Лигазной смесью трансформируют Е.coll IM101. Колонии исследуют на присутствие плазмиды с желаемой конструкцией. Одну плазмиду отбирают и обозначают pRH.242. в) Получение плазмиды pRH 243, содержащей дрожжевой ADH1-промотор, ген, кодирующий доминантный пептид дрожжевого фактора MF a, мультиклонирующее место и дрожжевой ADH1-терминатор. Ген доминантного пептида МРасинтезируют химическим путем с использованием дрожжевого кодона. Получение вектора. Плазмиду pRH 242 переваривают с помощью Xho1 и Xba1. Фрагмент очищают электрофорезом в агаровом геле, электроэлюацией и осаждением. Получение вставки. Получают следующие олигодеоксинук35 леотиды: i следовательность 1727533 MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACСОАТ6А (48-мер) MF 7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAÑ ACTACTATTGCATCGATTGCT (69 pep) MF 8 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG TTAGTGGAGTTGGAGAATG (69-мер) MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49-мер) MF 10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGCCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT (46-мер) 20 30 " С(Л(СТСАТАТЛСАЛТЯ(ATG (",АА TT(; СЛЛ СТТ ТСС ТСТ РТ ТТС 1ТТ ТЬТ ЛЛС АСТ Т(=Т ССА CAA Л.".С TQ Ы С.iАQТЛТЛТ(ТТЛСС ТЛС GTT ЛАС СТТ СЛА АСС ЛСЛ CCA 1"„ Е-.495: г:,Т СТТ ТТС АСС ТЛД. БАРМ,,Я 5 TCGAGCTCATATACA ATG CGAGTATATGT TAC ЛЛ САЛ ЛСЛ Л Т А ЛСЛ XhoI 155 160 165 Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT ТТС GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA ACA GGT CTT 60 пмоль каждого олигонуклеотида, за исключением MF 1 и MF 10, фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидуиназы (ПНК). 60 пмоль MF 1 и MF 2 объединяют. Объединяют также растворы MF 3 и MF 4, MF 5 и MF 6, MF 7 и MF 8, MF 9 и MF 10. Объединенные растворы нагревают при 100 С и медленно охлаждают до комнатной температуры. Затем все растворы объединяют, добавляют 20ед. Т4-лигазы и реакцию лигирования проводят при 14 С в течение 16 ч. 0,5 мкл векторной ДНК и 7 мкл раствора смеси лигирования объединяют и подвергают лигированию с использованием 5 ед. Т4-лигазы. Е.со И М101 трансформируется лигазной смесью. Из некоторых колоний выделяют плазмиды, анализируют их с тем, чтобы восстановить полный ген с использованием дрожжевого кодона формулы с помощью Xh01 и Xba1. Плазмиды, содержащие вставку размера 290 п.о., подвергают дальнейшей характеристике путем клонирования вставки в М1 Змр8 с последующим анализом с использованием метода Сангера. Плазмиду, содержащую ожидаемую вставку, обозначают как pRH 243. r) Получение плазмиды pRH 244, содержащей ADH1-промотор, последовательность, кодирующую водорастворимый фрагмент Fcq R и ADH1-терминатор. Получение вставки. Плазмиду pGEM4, содержащую больший Hindlll/EcoR1 фрагмент дДНК Fc,R, разрезают рестриктазами EcoR1 и Hindlll u обрабатывают фрагментом Кленова, дефосфорилируют, очищают и разделяют на агаровом геле, Синтезируют два линкерных олигонуклеотида формул 38 1727533 Lys Trp AAG TG 5 TTC ACC TAG Sau3A 5 ATG 3 TAC Glu Leu Gln Ча1 Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT ССА GAA СТТ AAC GTT САЛ AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG ТОА АСА GGT CTT Lys Trp AAG TG TTC ACC TAG ЯацЗА 45 синтезируют два олигонуклеотила формулы EBI-430: 5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA ТТ6 CAA GTT ТСС TCT GGT ТТС GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG EBI-437! 3 ТАССТТААС6ТТСАЛЛООАСАССААА6 ГАС СТТ AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА ТТ6 TGA АСА GGT СТТ ТТС АСС TAG Sau3A 25 пмоль каждого олигонуклеотида ренатурируют и добавляют примерно к 3 мкг фрагмента $au3A (5 -фосфат/EcoR1/встроенного, дефосфорилированного) и лигируют с использованием Т4-ДН К лигазы, Получаемый фрагмент Xho1-/EcoR1/ очищают путем электрофореза в агаровом геле. Получение вектора. Плазмиду pRH 242 разрезают эндонуклеазой ХЬа1, концы затупляют за фрагментом Кленова. ДНК разрезают Xho1 и больший фрагмент выделяют электрофорезом в агаровом геле. Вектор и вставку лигируют (лигирование встроенного EcoR1 места на встроенное ХЬа1 место приводит к восстановлению как места EcoR1, так и места ХЬа1), Лигазную смесь используют для трансформации Е.coll IM101, Из колоний выделяют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водорастворимого фрагмента с использованием некоторых рестрикционных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент Xho1 Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем, чтобы подтвердить правильную связь между ADH1-промотором и человеческим геном. Эту плазмиду обозначают как pRH 244, д) Получение плазмиды pRH 245, содержащей дрожжевой АОН1-.промотор, доминантный ген дрожжевого фактора MFa, ген водорастворимого фрагмента Fc< R и дрожжевой А0Н1-терминатор. Получение вектора. Плазмиду pRH 243 подвергают перевариванию с помощью EcoR1 и $tu1. Больший фрагмент очищает электрофорезом в агаровом геле, электроэлюацией и осаждением, Получение вставки. Плазмиду рОЕМ4/Рс В/ подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindi l I c последующим дефосфорилированием, Вставку гидролизируют рестриктазой $аиЗА и больший фрагмент выделяют. С целью восстановления полной области, кодирующей растворимый фрагмент формулы Met 1727533 10 20 30 40 ЫЛ-М6: ЯААСТССАС -НАй ТСТ Тi ТСБТТТЫСААСАСТТЯСССССА,ААЛ l8 В ЕИ- l 97: СТТСАСЫТССАС Л АЯАССАААССАААССТТЯТ ААСЫЬЯССТТТТТАССТАЯ5юФ -> У 25 пмолей каждого олигодеоксинуклеотида подвергают ренатурации и добавляют к 3 мкг фрагмента Sau3A — EcoR1. Реакцию лигирования проводят в растворе общего объема 20 мкл с использованием 74-ДНК лигазы. Получаемую ДНК очищают путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения. 1 мкл векторного фрагмента и 1 мкл фрагмента вставки лигируют. Лигазную смесь используют для трансформации Е.coli IM101. Из некоторых колоний выделяют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водорастворимого фрагмента Fc, R с использованием нескольких рестрикционных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент С(а1 — Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем, чтобы подтвердить правильную связь между участком фактора MFa и геном водорастворимого фрагмента Ес Я. Эту плазмиду обозначают pRH 245, е) Получение дрожжевых векторов. Плазмиды pRH 244 и pRH 245 конструируют с использованием вектора из Е.coli (Bfuescribe), который облегчает анализ вставок, Обе плазмиды разрезают с помощью Hindlll и BamH1 и лигируют в дрожжевой вектор pjDB207, содержащий 2и начало репликации и leu 2 избирательный маркер. Получение вектора. Плазмиду plDB207 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll u BamH1, Большой фрагмент выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения, Получение вставки. Плазмид pRH 244 и pRH 245 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll и 8amH1. Вектор и вставки лигируют в растворе и трансформируют Е.coli IM101. ДНК полученных колоний исследуют на правильность конструкции, Отбирают две плазмиды, одну из которых обозначают plD8 — 244 (содержащую экспрессионную которые восстанавливают считывающий скелет, начиная с второго кодона (GIu) гена растворимого фрагмента FcgR ренатурирукассету без доминантной последовательности MF а), а другую — как plDB — 245 (содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MFa). Обе плазмиды выделяют и используют для трансформации дрожжевого штамма WS21-3 (а, 1еп2, hls3, ura3, рер4), Стадия 2. Получение плэзмид 289а1 и 289 ЬЗ. Плазмиду УЕрг3 переваривают рестриктазами Hindlll и ВатН1. Линеаризованный вектор выделяют электрофорезом в агаровом геле. По 1 мкг каждой плазмиды pRH244 и pRH245 переваривают с помощью Hindlll и BamH1. Из рРН244 выделяют фрагмент длиной 1650 п.о., а из pRH245 — фрагмент длиной 1900 п.о. 50 нг линеаризованногс вектора и 200 нг фрагментов лигируют и используют для трансформации Е.coli Н В101. Отбирают штэммы, устойчивые к ампициллину. Плазмиды колоний исследуют на и равильность конструкции при помощи рестрикционных энзимов. Получают две плазмиды, которые обозначают 289а1 (из. pRH244) и 289b3 (из pRH245). Пример 12. Экспрессия растворимогс фрагмента Fc R в Е.coli, Получение вектора. Плазмиду pRH 100 (cM, пример Б) переваривают с помощью Ssf1, 3 -концы удаля. ют ДНК полимеразой 1. Линеаризованнук плазмиду дефосфорилируют. Получение вставки, 20 мкг pGEM4-Рс Я, содержащего боль. ший Hindlll — ЕсоЯ1 фрагмент дДНКдля Fc R подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindlll. 5 -концы затупляют фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1. 5 фосфатные группы удаляют с использованием фосфатаза кишечника теленка. После очистки в агаровом геле фрагмент, содержащий ген растворимого фрагмента Рс В, гидролизуют рестриктазой Sau3A и больший фрагмент выделяют, 50 пмоль каждого олигонуклеотида ют и медленно охлаждают. Олигонуклеотиды и вставку ДНК лигируют с помощьк 74-ДН К лигазы. 1727533 45 1 мкл линеаризованной векторной ДНК и 5 мкл ДНК вставки объединяют и лигируют. Половину материала используют для трансформации Е.coli НВ101 (Г, hsdS20 /rb —, mb/, rec A13, ara-14, proA2, 6с"I, 9а(К2, rpsL20 /SM-устойчиво/, xyt — 5, в(М, SupE44, лямбда минус). Плазмиды устойчивых к ампициллину колоний выделяют и исследуют на правильность конструкции при помощи рестрикционных энзимов. Одну плаэмиду отбирают и подвергают анализу соединения между Trp-промотором и геном растворимого фрагмента Fc R. После этого заключительного анализа плазмиду обозначают как pRH 246. Пример 13. Конструкция плазмиды pSFc R-1. а) 350 мкг pbSF2 — 38, который содержит дДНК для BSF — 2 в Sma1 вместе pGEM4, переваривают 700 единицами EcoR1 и BamH1 в 500 мкл буфера (100 мМ хлористого натрия, 50 мМ трис-HCk, pH 7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ДТТ) при температуре 37 С в течение 2 ч. Переваренную ДН К подвергают очистке путем электрофореза в 1%ном агаровом геле. Выделяют EcoR1 — BamH1-фрагмент, содержащий дДНК для BSF — 2 длиной 1,2 т,п.о. 20 мкг этого фрагмента гидролизуют единицами Hinf1. Экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагмент с тупым концом и длиной 127 п.о. экстрагируют фенолом, переваривают 40 единицами Крп), инкубируют 2,5. ед. бактериальной щелочной фосфатазы, после чего подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Полученный фрагмент длиной 110 п.о., содержащий доминантную последовательность BSF — 2, подвергают электроэлюации и осаждению этанолом, Фрагмент длиной 1IO п.о. лигируют с переваренной Крп1 и Sma1 плазмидой pGEM4 и трансфицируют в Е,coli (МС1065). Из полученных колоний отбирают клон, содержащий только одну доимнентную последовательность, его обозначают pBSF2 — L8. б) Плазмиды LE — 392 или pGEM4 (pFc< R-1) переваривают 150 единицами Hind II! и подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Фрагмент Hlndili, содержащий растворимый участок Fc< R, электроэлюируют из геля, осаждают этанолом и растворяют, Фрагмент Hindlll èíêóáèруют при 20 С в течение 30 мин в присутствии 8,2 ед. фрагмента Кленова и 1 мМ dNTP в среде 10 мкл 1 х буфера никтрансляции с тем, чтобы заполнить 3-концы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты Hindlll с заполненными 3 -концами гидролизуют рестриктазой Psfl и фосфорируют. pBsF2- 8 гидролизуют рестриктазой BamH1, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Затем растворяют, переваривают. нуклеазой Рзт!, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Переваренный Pstl фрагмент, содержащий кодирующий Fcz R растворимый участок, и переваренный Pstl фрагмент р BsF2 — L8 лигируют и используют для трансфекции E.coli (MC1065). Отбирают клон, обозначают psFc R-1. Размноженная плазмида psFc.-R — 1 содержит семь оснований от многократйого клонирования в рСЕМ4 между доминантной последовательностью BSF2 и последовательностью Fc< Я. Пример 14. Экспрессия дДНК для Fc, R. Плазмиду рз Ес Я-1, содержащую модифицированную дДЙК для Fc Xenopus leavis, которые инкубируют при 20 С в моди цированной среде Барта, содержащей 100 мкг/мл пенициллина и 1 мкгlмг стрептомицина. После двухдневной инкубации надосадочную жидкость собирают и ооциты подвергают гомогенизации в среде буфера PBS, содержащего 1 мМ ФМСФ. Л итазы Р BS разделяют путем центрифугировэния при 15000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат снова экстрагируют HR — 40 солюбилизации связанного с мембраной рецептора (0 5% НП-40, 0,1 М хлорида натрия, 0,05 M трис-НО, рН 7,5). Пример 15. Анализ Fc 10 ооцитов, в которые была введена мРН К, инкубируют при температуре 20 С в течение 24 ч в 100 мкл модифицированной среды Барта, содержащей 150 микС 35S ìåтионина. Маркированные ооциты лизируют в 1 мл буфера лизиса (0,5% НП-40, 0,1 М хлорида натрия, 0,05 М трис-HCf, рН 7,5) и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осветленные лизаты и надосадочную жидкость подвергают очистке на шариках сефарозы 4В со связанным мышиным иммуноглобулином, с последующей инкубацией в присутствии шариков сефарозы 4В, с которыми связано антитело 3/5, с которым связан иммуноглобулин G1. И н кубацию проводят во льду при частом встряхивании. Шарики промывают, продукты элюируют содержащим додецилсульфат натрия буфером путем кипячения в течение 1727533 20 30 45 55 2 мин. Образцы подвергают анализу с использованием додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (9%). Пример 16. Определение Fc R. Активность Fc R определяют методом эним, для чего используют два различных моноклональных анти-Fc М хлорида натрия, 0,05% таина, 20,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,02% азида натрия), Пластинки инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, промываютчетыре раза промывным буфером, после чего добавляют 100 мл антитела 8 — 248, с которым связана щелочная фосфатаза (0,75 мгlмл). После 4-часовой инкубации пластинки промывают 4 раза. Энзиматическую реакцию инициируют добавлением инитрофенилфосфата в субстратном буфере. Пример 17. Определение связывания Ес и с иммуноглобулином Е. Плашеты, снабженные покрытием из антитела 3 — 5, инкубируют вместе с образцом в течение 2 ч, промывают, добавляют человеческие моноклонал ьные иммуноглобулины (РЯ миелома). После двухчасовой инкубации при комнатной температуре пластинки промывают и инкубируют со щелочной фосфатазой, связанной с моноклональным античеловеческим иммуноглобулином, проявляют добавлением и-нитрофенилфосфата в субстатном буфере. Пример 18, Образование розетки иммуноглобулина Е, Рс К на лимфоцитах определяют путем анализа с использованием зафиксированных от RBC, снабженных покрытием из человеческого иммуноглобулина. Число розеток образующих клеток определяют после вычета числа неспецифического связывания с зафиксированными ох RBC, покрытыми альбумином сыворотки крупного рогатого скота. С целью торможения розетки иммуноглобулина Е 25 мкл несущих Fc Анализ с использованием додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (a) показывает, что продукт psFc R — 1 из ооцитов, который распознается обоими антителами 3 — 5 и 8-30 и имеет связывающую иммуноглобулин активность с получением широких протеиновых полос и продукт рЛ МЕс  — 1 из ооцитов, который не имеет N-концевого трансмембранного участка и может распознаваться антителом 3-5, но не антителом 8 — 30 (б) и который не проявляет связывающей иммуноглобулин Е активности. Эти результаты свидетельствуют о том, что продукт р Л NFc< R — 1, который не имеет сигнальной последовательности, не перерабатывается нужным образом и что подходящая обработка, как в клоне psFc R-1, создает эпитоп, который распознается антителом 8 — 30 и имеет связывающую иммуноглобулин активность. Экспрессию водорастворимой части рецептора Fc R проводят путем культивирования соответствующего штамма Е,coli, дрожжей или клеток другого организма в общепринятых условиях с последующим концентрированием и очисткой полученного водорастворимого фрагмента, Дрожжевой штамм WS21 — 1, трансформированный плазмидой 289ЬЗ (WS211/289е), культивируют в течение 40 ч в среде УН К8 до оптической плотности (546 нм), равной примерно 45 (вес сухих клеток 13 г/л), После отделения клеток путем центрифугирования выход Рс R составляет 2,5 ед/мл Рс R (1 ед/мл Fc< R соответствует активности надосадочной жидкости, равной 1х10 клеток RP M1/мл). Формула изобретения Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства Fc, заключающийся в том, что выделяют водорастворимую часть связывающего иммуноглобулин Е-фактора Fc R из лимфобластоидных клеток RPM1 8866, очищают ее хроматографией, подвергают гидролизу, затем выделяют фрагменты, определяют в них аминокислотную последовательность, на основании которой синтезируют олигонукт л леотид 3 -ТТс АСС ТА G ТТ G АА GT-5, А G G параллельно из клеток RPM1-8866 выделяютполи(А) -РНК,синтезируютдДНКдлиной более 1000 Ьр, которую клонируют в EcoR1 сайт-ламбда gt10, далее осуществляют гибридизацию дДНК Fc,-, R L с синтезированным олигонуклеотидом, отбирают вставку 1727533 46 15 25 35 45 Составитель Т. Забойкина Техред М.Моргентал Корректор М. Демчик Редактор М. Циткина Заказ 1284 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб„4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 дДН К длиной 1600 kb, которую клонируют в EcoR1 сайт-плазмиды LE392 или pGEM4, гидролизуют полученную ДНУ эндонуклеазой Pstlll, полученный фрагмент длиной 1,0 kb заполняют фрагментом Кленова ДНКполимеразы, далее ДНК переваривают Pst1, полученный фрагмент клонируют в вектор pBSF2-L8, обработанный эндонуклеазами BamH1 и Psf1. получают экспрессионную плазмиду psFc R-1 для Fc< R, одновременно Hindlll — EcoR1 фрагмент вставки из плазмиды LE392 клонируют в вектор pGEM4, получают р6ЕМА4-Fc„R, которую обрабатывают EcoRI u Hindlil эндонуклеазами, 5 -выступающие концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех деоксинуклеозидтрифосфатов, 5-фосфатные группы удаляют, полученный фрагмент после очистки обрабатывают Sau3A, больший фрагмент лигируют с олигодезоксинуклеотидами ЕВ1496 и ЕВ1497 с помощью Т4-ДНК-лигазы, далее ДН К лигируют с линеаризованной векторной ДНК, которую получают путем обработки плазмиды pRH100 эндонуклеазой Sstl, удаления 3 .-выступающих концов и дефосфорилирования, и получают плазмиду pRH246 или одновременно дрожжевую плазмиду УЕр13 гидролизуют Hindlil u BamHI рестриктазами и линеаризованный вектор лигируют с Н! пб!П-.BamHI фрагментом длиной 1900 bp плазмиды pRH245 с помощью Т4-ДНК-лигазы, получают экспрессионную плазмиду 289b3, ранее полученными плазмидами pRH246 и psFc R-1 трансформируют бактерии Е.соА НВ101, а эксп рессион ной плазмидой 289b3 — дрожжевой штамм WS21-1, культивируют трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с помощью хроматографических методов.
