Рекомбинантная плазмидная днк ртнуз14, кодирующая полипептид со свойствами тимозина @ человека, рекомбинантная плазмидная днк ртну12 - промежуточный продукт для ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент полипептида со свойствами тимозина @ человека
Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является повышение уровня синтеза полипептида со свойствами тимозина ai человека. Получены рекомбинатная плазмида рТНУ314, кодирующая пептид со свойствами тимозинэ а человека, штамм E.coll ВКПМ В-5056, обеспечивающий синтез полипептида со свойствами тиИзобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической .инженерии. Тимозин a один из более, чем 30 пептидов низкой мол.м. (1000-15000). выделяемых из вилочковой железы (тимуса), обладает мощной общей иммуностимулирующей активностью. Тимозин «1 синтезируется в организме в виде предшественника, мозинэои человека, и рекомбинантнад плазмидная ДНК рТНУ12, являющаяся промежуточным продуктом для получения плазмиды рТНУ314. Рекомбинантная плазмида рТНУ12 содержит синтетический ген полипегпида со свойствами тимозина а человека, состоит из Hind Ill/Cla I - фрагмента ДНК плазмиды pCPG2, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 раччей области бактериофага Т7. синтетический участок инициации трансляции, гены / -лактамазы и хлорэмфениколэцетилтрансфергзы и терминатор транскрипции фага ). Clal/Htnd II - Фрагмента, содержащего сичтетический ген. кодирующий ц:му: ый пег,- тидтимозина й человека. РексмСч-мЗг -няя плазмидная ДНК рТНУЗ 4 содержит ген полипептида со свойствами тирозина а человека , который конститутивно экспрессирует в клетках E.coli в составе химернот ПСПУ.Э фактор некроза опухолей -тимозгн ;;. Штамм Escherichia coli SG20050/pTHV314 обеспечивает уровень биосинтеза тимусного пептида тимозина а человека до 8 - 10 мкг/мл при упрощенной технологи;. его выделения. 3 с.п. ф-лы. от которого он отщепляется и затем подвергается N-концевому ацетилированию. N- дезацетилтимозин сп обладает набором биологических активностей натипно о пептида , в частности тимозин щ стимулирует Т-клетки, индуцируя синтез интерпейкина-2 и /-интерферона, делая их эффективными против широкого ряда патологий, таких как С Ssl I и ь
СЭ1ОЭ СОВЕТСКИХ
С ОЦИ А П И С ТИЧ Е Ск ИХ
РЕСПУБЛИК
rs»s С 12 N 15/12 15/21
ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4, 60812/13 (22) 21.11.89 (46) 23.01,92. Бюл. hk 3 (71) Институт биоорганической химии им.
M.Ì.Øeìÿêèíý (72) В.Г,Коробко. Е,Ф.Болдырева, B.Н.Доб ынин, С.А.Филиппов и О.А.Амосова (53) 575.173(088.8) (56) Biochemistrv. 1980. ч,19, р.6096-6104. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рТНУ314, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД
СО СВОЙСТВАМИ ТИМОЗИНА а1 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ
ДНК рТНУ12 — ПPQMЕЖУТОЧНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI—
ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ТИМОЗИНА а1 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.
Целью изобретения является повышение уровня синтеза полипептида со свойствами тимозина а1 человека. Получены рекомбинатная плазмида рТНУ314, кодирующая пептид со свойствами тимоэина Q1 человека, штамм Е.coli ВКПМ В-5056, обеспечивающий синтез полипептида со свойствами тиИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической, инженерии.
Тимозин a1 — один иэ более, чем 30 пептидов низкой мол.м. (1000 — 15000). выделяемых из вилочковой железы (тимуса), обладает мощной общей иммуностимулирующей активностью, Тимозин Q1 синтезируется в организме в виде предшественника, » Б12„„1707075 А1 моэина а1 человека, и рекомбинантна.» плаэмидная ДНК рТНУ12, являющаяся промежуточным продуктом для получения плаэмиды рТНУ314. Рекомбинантная плазм«да рТНУ12 содержит синтетический ген полиг1еп1 1да
СО СвсиСтаами тимОЗина Q1 чЕлОвЕка, CQCT0ит из Hind III/Cia I — фрагмента ДНК г:лазмиды pCPG2, содержащего танде промоторов транскрипци« А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7. синтет«ческ«й участок инициации трансляции, гень >3-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансфергэы и терминатор транскр«пц«1 . 4 ara ).
Clal/HInd Ill — фрагмента, содер.»:эщето с " тетический ген. кодирующий т м --.ь. Пептид ти лозина а, че;с века. РексмЬ а; -ная плазм«дная ДНК рТНУЗ i4 содт-рж«т ген полипептида со свсйствам; т оз«на;1:-ловека, который констит.;идно эксп Гесс«рует в клетках Е.coli в составе химерно.е белка фактор некроза опухолей — тимов
Штамм Escherichia coli SG20050/рТН".314 обеспечивает уровень биосин1еэа т«мусного пептида тимоэина Q1 человека до 8—
10 мкг/мл пр«упрощенной -.åõHçnc.f«. е;о выделения. 3 с.п, ф-лы. от которого он отщепляется и затем подвергается N-концевому ацетил«рован«ю. Мдезацетилтимозин а1 обладает наборс; биологических активностей нат«иного пептида, в частности тимозин Q1 стимул«рует
Т-клетки, «ндуцируя синтез «нтеслейкина-2 и у-интерферона, делая «х эффе.:т«-,н..:м« против широкого ряда патолог«й, таких как
1707078 инфекционные и опухолевые заболевания, ревматизм, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и др. Комбинированное применение в медицинских целях тимозина п1 с другими препаратами, например с аспирином, перспективно в иммунотерапии рака легких, Препарат аспирин-тимоэин Q< предотвращает заражение вирусом СПИД.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является плазмидная ДНК рТН а P gal, кодирующая синтез пептида со свойствами тимозина а1 человека (11.
Известная плазмида обладает рядом недостатков, к числу которых относится низкий уровень экспрессии гибридного белка (менее 1 ), необходимость проведения индукции биосинтеза белка, что усложняет технологию культивироавания клеток бактерий, гибридный белок аналога содержит
23 остатка метионина, что делает процесс выделен " я целево. о продукта трудоемким.
Цел ю изобретения является повышение уооеня синтеза полипептида со свойствами ти.лозина rxI человека.
Дчя этого сконструирована рекомбинатная плазмида рТНУ12, являющаяся промежуточной для конструирования рекомбинантной плазмиды рТНУ314, кодирующей конститутивный синтез гибридного белка. от которого пептид со свойствами тимоэина l человека отщепляют гидролиэом ".ð ìöèàíoì. Получен штамм Е.coll SG .Г0=.0 рТН r 314, обеспечивающий высокий ровень якспре сии гибридного белка
1актор некрчэа опухолей — тимозин а1, из которого пслу ахают 8-10 MKI тимоэина а на
1 мл кчеточной суспензии при плотности с клеток 10 кл./мл.
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУЗ14, кодирующая химерный белок— фактор некроза опухолей — тимоэин и1, xapav.;еризуется мол.м. 2.57 Уд (3,98 т.п.о,) и
CC C TOMTIT ИЗ:
Pstl-ЯаиЗА! — фрагмента ДНК плазмиды
pTNF314 Л. Содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с синтетическим участком инициации трансляции и часть гена/ -лактамазы (1,48 т.п о.);
Clal/Pstl — фоа мента l ДНК плазмиды рТНУ12, содер к ащего синтетический ген, кодирующий тимусный пептид тимоэин at, ген хлорамфениколацетилтрансфераэы, терминатор транскрипции фага 1 и часть гена Р-лактамазы (2 49 т.п.о );
ЯанЗА! /Clal — синтетического линкера, соединяющего в единой рамке считывания ге55
Сегмент В:
50 ны фактора некроза опухолей и тимозина а1 (15 п.о.), Рекомбинантная плаэмидная ДНК
РТНУ314 в качестве генетических маркеров содержит гены Р-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансфераэы, определяющие устойчивость трансформированных плаэмидой рТНУ314 клеток Е.coll к хлорамфениколу и пенициллиновым антибиотикам, а также уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта Kpnl: Вв1Е(! — 405 нуклеотидов; Bglll — 492 нуклеотида; Hlndl ll — 586 нуклеотидов, Pstl — 3779 нуклеотидов.
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ12, являющаяся промежуточным продуктом при конструировании рекомбинантной плазмидной ДН К рТНУ314, характеризуется мол.м, 2,58 Мд (4,02 т,п.o.)
И СОСТОИТ ИЭ;
Hlndlll/Cla1 — фрагмента ДНК плазмиды
pCPG2, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, синтетический участок инициации трансляции, гены j3-лактамаэы и хлорамфениколацетилтрансфераэы и терминатор транскрипции фага k(2,49 т.n,o.):
Clal/Hindlll — фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий тимусный пептид тимоэин а1 (0,1 т.п.о.).
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ12 в качестве генетических маркеров содержит гены / -лактамаэы и хлорамфениколацет илт рансфереэы, оп ределяющие устойчивость трансформированных плазмидой рТНУ12 клеток Е.coll к пенициллиновым антибиотикам и хлорамфениколу, а также уникальkûe сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта BamHI: Clal — 24 нуклеотида; Bglll — 75 нуклеотидов; Hindi l I — 118 нуклеотидов;
Ncol — 729 нуклеотидов: Pstl — 2573 нуклеотида.
Для получения искусственного гена, кодирующего тимоэин al человека синтезируют фосфорамидитным твердофаэным методом восемь олигодеэоксирибонуклеотидов величиной от 21 до 29 нуклеотидных звеньев. Лигаэные сшивки проводят в два этапа.
Сегмент А:
1 Р и1 мпслтссл TATGAcccAT CTcAcAcTTcTTcTcAAATcAccAccA
CT ACCT AT AcTaZT ACCACC ACATCTC ISAAC ACTTT ACICCTCATVVCV
V 1
У 1 C
VII
cTAAAcAтстглллслмм:лллслссттстсслссл.кстсммстл лсмтттсттттстт стссмcAccTccTTccAcnTTcATTccA
Т! Ъ VIll
1707078
На первом этапе проводят две четырехкомпонентные сшиеки, причем все олигонуклеотиды перед сшивкой фосфорилируют при помощи АТР и Т4 полинуклеотидкиназы, эа исключением 5-концевого олигонукI леотида (l) иэ сегмента А и олигонуклеотида
Vill иэ сегмента В. На втором этапе сшивают Т4 ДН К л и ге з ой сегменты А+В, которые предварительно очищают электрофореэом е 15 -ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Получившуюся в результате 101эвенную двухцепочечную ДНК очищают электрофорезом в 8 -ом ПААГ.
После этого искусственный ген тимоэина а1 человека клонируют в плазмиде
pG E M4. Для этого ДН К пл аз миды pG E M4 сначала расщепляют рестриктазами EcoRI è
Н(пбИ1, затем полученный вектор лигируют с синтетической ДНК. После трансформации лигазной смесью компетентных клеток
Е.coll HS101 скрининг нужных клонов пооводят гибридизацией колоний1п situ с (Р)3 мечен ными олигонуклеотидами (!) и (VI I I). Из клонов, гибридизирующихся с обоими радиоактивными зондами, выделяют плазмидную ДНК рТНУ1-4, анализируют ее с помощью рестриктаз Haelll u Mspl и подтверждают структуру вставки определением нуклеотидной последовательности модифицированным методом МаксамаГилберта.
Полученная таким образом рекомбинантная плазмидная ДНК р ТНУ1 4 содержит искуственный ген тимозина Q1. который может транскрибироваться SP-б РНК-полимеразой, и может быть использована для препаративной наработки РНК для бесклеточной трансляции с использованием лизатов ретикулоцитов кролика или экстрактов иэ проростков пшеницы.
После этого синтетический ген тимозина Q> реклонируют по сайтам Clal u Hindlll в плазмиду pCPG2. В результате получают новую рекомбинантную плазмиду рТНУ12, являющуюся промежуточной для конструирования целевой плазмиды рТНУ314, содержащую ген тимозина п1, которому предшествует последовательность сайта инициации трансляции (последовательность Шайн-Дальгарно), причем транскрипция тимозин Qi — специфической PHK обеспечивается тандемом сильных промоторое А2 и АЗ бактериофага Т7. Таким образом, плазмида рТНУ12 контролирует прямую экспрессию гена тимозина Q> и может быть использована для бесклеточного биосинтеза пептида с помощью сопряженной прокариотической системы транскрипции-трансляции.
Для дальнейше о k,о«стр <йр R < «а <спользуют плазмиду рТН1 <Е31 Л Л, кот;>р « является производной рекомби«л., «ой плаэмиды рТМЕ311 Л с «еизк1ен о< с помощью сайт-направленного у<аге«еза Cконцевой частью гена фактора г е ргза опухолей человека. В результате такого мутагенеза ILe>ss заменен на остаток Leu, а в ген фактора некроза опухолей влете« у«.;кальный сайт рестриктазы BamHI ДНК плазмиды pTNF314 Л подвергают c.": г, ее<ному гидролизу рестриктазами BamHI и Рз и выделяют векторный фрагмент.
ДНК плазмиды рТНУ12 гидролизуюг эндонуклеазами Clal и Pstl, после чего злектрофорезом в 5 -ном ПААГ выдегают фрагмент величиной 2,5 т.п.о., ccдержаi<ий структурный ген тимозина а1. После этого вектор лигирует с Clal — Pstl фрагментом плаэмиды рТНУ14 в присутствии си«тетического дуплекса:
GATCATTGCCCTGAT (IX)
TAACGGGACTAGC (Х)
Часть лигаз«ой смеси используют д I трансформации компетентных кле-.о . Е.со
НВ101. Трансформанты высевают «а ага,",<зованную среду, содержащую а, г<иц,.- л,;« и хлорэмфеникол (по 50 мкг/Mn) и прг ведат скрининг гибрг дизац1ей колоний с Р к =. еным олигонуклеотидом GATCATTG< CCTG i, Из гибридизующихса клонов в.„дел г ют плазмидчую ДНК рТНУ314 L1 а«ал« . зг ее с с<с oùüþ рестриктаз На-.l i . 1. Г, Для получени штам ".в — п;,=дуц «-а пептида с биологической а«авив«":тью т. i азина а1 человека плазмид«ой рТН . 31<4 трансформируют компетентные клетм и
Е.coll SG20050.
Полученный штамм Е.coli SG20050/
/рТНУ314 характеризуется следующими признаками.
Морфолсгические пр 1з«аки.
Клетки мелкие, утолщенной палс Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Прг росте на агаре "Дифко" — колонии кругль<е, гладкие, прижаты, мутные. блестящие серые, край ровный. При рос е в жидких средах(на минг мазь«сй Среде с клюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40 С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0. В кa«естве источника азота используют как л1l «еральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пепто«а, 7 1707078 Tp»тона дрож>кев .<го кcTp»» fl0T и т д В качестве источника q°, " =pодэ используют 3>линокислсть>. глиц >o«» ytrët=BOД Ь> Устойчивость v ачтибио иуам Клетки проявляют устойчивось > 3>лп«вЂ” циллину (до 300 мкг/мл) и хлорам+<ениколу (до 500 мкгlмл), обусловленную наличизм плаэмиды, а также к тетрациулину (до 25 мкг/мл), благодаря наличию трансппзонд. Штамм Е.coll SG 20050/рТНУ314 обуславливает конститутивный синтез гибридного полипептида — фактор некроза опухолей — тимозин FIl, от которого пептид со свойствами тимозина а1 челове а может буыт Отщеплен дг йствиеул бромциана. при-ем уровень биосинтеза гибридного белка составляет свыше 20,4 тотального клеточ>о абел а бэк-ер> й, чтосоо1ветствует8 10 кл> l Г птид«на 1 мл >.леточчои сус печа!<1 Шта>лм депо««рован во Всесоюзной коллекци«промышленных ми. Гоорган«змов BHl". 1гечет» э под,<о>лег<ол< В КГ1М В— 5056 П р и м. P p 1 Хилл><КО <, Ер лвч-.ат«р л!.<й с«чтез ис, г< i«чнгуо с Tp!yvT, ã 0<0 Геча « t < < и <- -э, i I ? < B3 с «Он, ",BBT«.",cB Рыг.-? <ак>т .RP! < л<е". э п <е н-.. o "ц <" Р = - > ем и",И ° . ° --1 дн;.. - -«я <: г > г-«ляч> «с т 3у 5 vo><, -; л "щЬ<0 ацЛ«ц: <ЧЫХ С<л 3<., ° -, ° тOB, -;,; к<=- «-l ° TP«ò«<<-Г„ :;1и. -2 - е< к< и><,к1. ° 0 ><3 I <-тоусил««зопроп: ° ламин J) ocф«TOB эхт. ° вi pовач° tip TBTрэз-;с;к Си <тез и,;",.г Од?т е масшта F.e 0.5 -0 7 t v.hlo. s l o;,;ь? >я в каче тг1е носи ел посисTo< cTPv :. {I àзмер ппр 500 А, размер частиц 40-8, h«.м> отооому через 3 -cy ° цичатч> >0 0 3ÿçü гри —.oeд«ня>oт .первое нуулеозт д> Ое звечп(нагрузка 20— h Ë "Ь < "" <С "к . УЮТ "V>TPL<ЧЕ< К1<>Л B > О T 0 >, . М ll 0 Г 1 B Р Е 3 > !,, << > O >< 3 P Н Г Э $ и И t OC З<<Д<> ПРОк<Ы V y - O".Ь<:>лЕСЬЮ TET PB! ИДг:ф„ран — пиридич — BoII3 {5 3 2) После Око <чан«я синтеза защитные гр)п ы удаляот последовательной обработкой тиофенолятом Тр«3Т« l3> Moч«я и уонцечтриГ<ОВЗННЫМ аММИауол Пр«эл)t4 Г рОИСХОдИт Отделеие Ол> гонуулеотидз От носителя 53> мето>.с ° тритильч,ю групп„удаля>oT кислотной обрабо-у".> v олигснуклеотид Очищэот электрп1зпезок< в 20$-ном ПААГ. содс„хкащ t< 7М h>oч вину Выход 1-5 о.е Смесь 250 пмоль Олигонуклеотидэ {I) и 200 пмоль каждого фосфорилироеанного Олигочуклео-ида {11)и (1 I) и 250 пмоль фос",0pили;1овачнсго олигочуулеотида {IV) на5 55 г(евак т 10 л MgCI затем >лдле< чо охлаждают до 15 С прибавля>" I А1Р д уг> цлнтрации 0 ". мМ ди >иотреит до у".-ц> траци>. 10 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы См oü инкубируют 6 ч при о 15 С, затем депротеинизируют двухк ратной фенольной экстракцией. ДНК вь<саживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 157ь-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину. Очищенный продукт сшивки элюируют из геля электроэлюцией на бумагу ОЕ-81. которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCI; рН 8 0; 0,5 MM ЕОТА) и этанолом, Нуклеотидный материал злюируют при помощи 1 5 M раствора NBCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефаде сом С-50 Выход сегмечта А 140 пмол Аналогичным образом получают сегмент В Ву:ход 180 г.мог ь Далее . цивают по 50 пмоль Каждого сег>< н-3 А и B B 0 >. кл буф ра, содержащего 20 мМ тр«С-HCI, OH 7 5 10 >лМ MgCII. 0.2 мг<><г А < . 1 vM дитиоTpevT (буфер C) и 50 ед Т4," <К-лигазы. в;ечечие 4 ч при 11Г10, хт Сон<В< < к<, д ";>" > 1Е>, Гр<С ФО p»-<> i< в <,- чом fli 3с1 п>ло ь -,г, к<уру Boo .» y очных и конечных п>родухтов ли;азных реакции подтВЕГж?а--т --а I -ОМ Н; к ЛЕОтИДНОй ПОГЛ "Д Ь-; as 0CT! Г « -. р > с>« . p èI10вэчие p""кпмби P3><1)< "й г 3,-> «д>;, -1к рТ>>у1 -4 Кл-т>, г ау геоий Е col«, .1; 01, c Jäåpæ3щ«!i, î ДНу рГЕу. 4 выращивают пои 3 .: B I F бульсне. содержащем 100 м> -, «" >. 0,<цил;ина дэ СтациСнаонОй фазы 3атг»л v. BTv« -.. ыделяют известной ПРО. ЕД, . С М Диф«К .ЦИЯМИ, ЗакЛЮЧаЮщимися! .Ом 4 и к сл,пернатанту. полученному ппсле подкигления ацета ом натрия прибавг»->От РНКазу А до кг чцентрации 10 мкгlt . см.сь инкубируют 20 м>лн при и 37 С. экс-„.аг руют дважды смесью фенолхлороФорм {1;1) и ДНК высаживают этанолом. Осадо растворяют в TE-буфере, содержащем 1 М NBCI. при>.авляют полиэтиленгликоль (ПЭГ 6000) до концентрации 1.5 ", вь<держиеают 1 ч при 0"C. цент риФугирую. 10 мин при 10000 сб/мин а осадок про>лывают 70 > ным этднолом, высуш <ва От и ра творяют в ТЕ-буфере Выход плазк;<дной jiHI . опреде, яют спектрофотометрически п ри 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 О.е./улг. Аналогичным образом выделяют ДНК плгзмиды PTNF314 Л, содержащую мутантный ген Ф3ктОрэ некроза опухолей челове17070 8> ка. а также новые рекомб> Ita> ные плдзмиднь>е ДНК рТНУ1 4, рТН
Полученныи препарат плдзл идной ДНК pGE.M4 используют для конструирования плазмиды рТНУ1-4, >.второе пр"водрс сге, дующим образом 5 мкг ДНК плазмиды рбЕ>1 1 инкубиру.ют с эндонуклеазами рестрикции EcoRI u Hindlll (20 ед. ка кдой) в 100 мкл буфера В (20 MM трис-HCI: рН 7,5: 50 мУ МдС> 10 мМ VgClg; 5 MM меркаптоэтанол) 1 ч при 37 С. После инкубации реакцию останавливают двухкрэтной экстракцией смесью фенолхлороформ (1;1). Анализ полноты гидролиэа и выделение векторного EcoRI/Hindlll— фрагмента проводят электрофорезом в 1ф,ном агарозном геле. Далее 1 мкг векторной ДНК соединяют с 0,2 мкг синтетического двухцепочечного фрагмента из примера 1 с помощью 30 ед. Т4 ДНК-лигдзы в 50 мкл буфера С в течение 6 с пр» 15 С. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформдцс v клеток Е.co)i JM101, для чего клетки e iccEa>oT на агар, содержащий среду М9, 0.27, глюкозы и 2 мкг/мл тидмина. Единичную колонию вносят в 50 >лл питательн.pro бу ьоча и выра цивают прМ 37 С до мутности 0.3-0.5 Зд1ел1 клетки охлаждают, осаждают цечтрифусированием(10 мин, 5000об/ML<>-I), nромыоают раствором 10 мМ MgCI;, центрифугируют суспендируюс e?0 м." 0.1 >1 рдстоогд CaCI." и выдерживают 30 л ин при 0 С. Г1г>гле цечтрифугировдния клетк» ресуспенд <руют в 3 мл 0,1 М СаС1 и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 Mr,r лигазной смеси смешивают с 50 r«n 0,05 м CaCI, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают 30 мич при 0 С, затем 2 мин при 42 С и снова 10 мин при ООС, после чего прибавляют 1 4 мл LBбульона, инкубируют ч при 37 С и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, Полученные колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание гена тимозина ctt гибридизацией колоний in situ с (P)-меченными олигонуклеотиддми (>) и (Vl! I). Колонии. дающие полсж»тельную гибридизацию с обеими пробами, отбирак. т и выделенную из них плазмидную ДНК ачализируют при помощи эндонуклеаз Haelll u Mspl. Окончательно структуру рекомб»нантной ДНК рТНУ1-4 подтверждают определение>л части ее нуклеотидной последовательности между сайта>ли ЕсоRI u Hindlll. Пример 3. Конструирование реко>лбинантной плазмидной ДНК рТНУ12.,r1HIr aR 1: qII пГс Г2(5л<кс) сидролизуют сoR лестно энде>< уклсд: дмl1 рестрикции (по 10 >"д каждой} f lal Li Hi>idlll в 100 л<кл бул ерд Р в i.-«.--н 1 г; -с-;1 3 . (Г1.з< пе 5»>ILL f .Lii />par>rE > Затем 30 мкг ДНК плдзмиды рТНУ1-4 г«д1О ролизуют в том wR буфере с помощью с>лес 1 60 ед. каждой из рестриктаз Clai v rlindlll, после ч>. го оыделя от электрофорезпм о 8$ном ГААГ фрдгмечт оеп«ч»ной 93 п.о., содержащий синтетическк<й >еч т«моз»нд г:1, 15 ПОСлЕЭтОгО Riirlip; Ют r>,15;лкг Зт гО фрдг>ле,"д с 0.6 >лкг С>а>/Hirdll! pCPG2 в ?5 мкл буфеоа С о прис c свии 50 ед. Т4 ДНК лигазы. Через 3 ч при 15 С 5 м..л лигазчо>1 с>леси 1!спользуют дла тpa" сфор20 мдц«и комг.eTe> 25 гена т«>лс:, 1»д гс, Из гс<бг>>дс<зирчющс<хса КЛПНОО О д П;- т ДНК, д>ian«эi руЮт ЕЕ С по>. ощ=" рос.р.<ктаэ Hae!! I » ",sp! 11 подTPRI,,äaIn-.L Ст ук" ру.-."рЕдЕ.;a>i.- л чъ>;Егт»дНОй ПОСRräO-:дтс,"h>no-l1 *1;.;; ф«ц. p 30 однчь м мето,>o>1 l. ° 1 р р 1; ">.c pr Lipo ER «n - - vo»5I<1 ->Рт, -, 1 — )- -, ° 1-,, и, 1 «-» - П (-, Дг<, t,RЗк<,1 <, t Г: >-) < ? (II1 л<> t) Обр г,9 !1>я 6,фс q LB E,-Tр«>L â€,a<-t, ° 35 С д >1 рг>. (пе 20 ед } о тел.=>,1>, ч гр«37 фрэгл<ент вези"иной .49 т.п о о.">дел :ют электрсфооезf л1 в 1 -,-нс> ° геле н«зкзп.>докой дгароэы.,5 мкг ДНК плдзмиды рТН JF314 Л гигоолс<зую< рестр»ктазами 40 ВдлпН! и Pstl (по 20 ед1 в течение 1,5 ч при 37 С и выделают фоагл ент епл«чиной о 1,48 т.п о, содеркя>.ии и tor.1oToph: -ганскрипц«и и муTa>ITti>lf1 -е>< с, -I of a > креза опукс;,ей челоо=.кд. 3;" О." r<,ã голучен45 Horn фparrio.ч;д RHÊ лигирч ют о 25 >лкл буфЕра С С 0.5 мкг Ee> TOp>.OL< ДН К, пОлучЕннОй иэ глаз <с дь: рТНУ12 с о,;<гоч v;,enT«paML1 (IX) и (Х) (по 0,2 >лкг каждого) с помощью 50 ед Т4 ДНК-я»газы в Te«ei 15 С. A;,L<>L:o-,y реакционной criеc» ..crto ьзуютд;я трао" формац1«кол<петентных клеток Е сс I Трдчсфорл<днты высеод>от на чэшк«с 1.В-дгарсм, сг>деp:<;дщ>" à . 55 (50 ;.г/>1л). Скр.<н»нг ге>;г лби><днтоо прозе водят rvбр д»здцс<ей колоний с (P) ><елейным олигону -еотс<до>л ((Х). Из гибр»дизующихся клонов выделяют плдзл1»дну>о ДНК pTI-IV314, которую а><а."»з. ру1707078 12 ют рестрикционным анализом с помощью эндонуклеаэ Haelll u Mspl и определением нуклеотидной последовательности области стыковки структурных генов фактора некроза опухолей и тимозина а1. Пример 5. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами тимозина а1 человека. Плазмидой рТНУ314 трансформируют компетентные клетки Е.сой SG 20050 по методу примера 2 и получают штамм-продуцент полипептида со свойствами тимоэина а1 чЕЛОВЕКа. Пример 6. Определение продуктивности штамма Е.coll — продуцента полипептида со свойствами тимозина Qt человека. Клетки Е.coll SG 20050/pThy314 выращивают при 37 С в 1 л LB-бульона. содержащего ампициллин и хлорамфеникол (по 30 мкг/мл) в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин. Клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин. затем суспендируют в 15 мл буфера. содержащего 107ь сахароэы. 50 мМ трис-HCI. рН 8,0, 0,2 мМ NaCI и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид. и озвучивают пульсами по 30 с, при частоте 22000 Гц в течение 10 мин при 4 С. Полученный лизат центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин. Осадок суспендируют в 10 мл.7 М гуанидинхлорида при 4 С в течение 6 ч. супернатант после центрифугирования разбавляют 10 объемами холодной воды, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок (no данным SDS-элехтрофореза в 13 -ном ПААГ > 90 ) -ной чистоты химерный белок— фактор некроза опухолей — тимоэич Qt; 0,7 г влажной массы) суспендируют в 10 мл 0,17, BrCN в 80 -ной муравьиной кислоте. и смесь перемешивают 16 ч при 20 С. после чего растворитель удаляют в вакууме при 30 С. Остаток суспендируют в 2 мл 7 М мочевины, доводят рН раствора этаноламином до 50 и вст ряхивают 2 ч и ри 20 С. после чего разбавляют водой до обьема 50 мл и выдерживают при перемешивании 12 ч при 4 С. Осадок удаляют центрифугированием (30 мин при 15000 об! м 1н), раствор наносят на колонку (1,2хЗС см) с ОЕАЕ-целлюлозой DE-52, уравновешенной 20 мМ ТЕАВ (рН 7,9). Для элюции используют градиент концентрации NaCI в том же буфере. Дезацетил-тимоэин ai элюируется с колонки при концентрации NaC10,2-0.3 M. Фракции, содержащие пептид. обьединяют, концентрируют лиофилиэацией и хроматографируют в 10 мМ аммоний-бикарбонатном буфере на колонке (1х50 см) с Ultrogel AcA 202. Фракции, содержащие ти5 55 мозин r1, обьединяют и лиофилизируют. Получают 8,5 мг пептида. частота которого > 957ь. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать пептид со своиствами тимоэина а1человека с уровнем биосинтеза 8-10 мкг/мл культуры клеток. При этом технология его получения значительно упрощается за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка. Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ314, кодирующая полипептид со свойствами тимоэина а1 человека, размером 3.98 т.п.о. и мол.м. 2,57 Мд, содержащая: -Pstl - Sau3AI — фрагмент ДНК плазмиды pTNF314 Л размером 1,48 т.п.о., с полусин- . тетическим геном фактора некроза опухолей человека и синтетическим участком инициации трансляции: -Clal-Рвт! — фрагмент ДНК плазмиды рТНУ12, размером 2.49 т.п о., с синтетическим геном, кодирующим полипептид со свойствами тимоэина а1. -Ба03А1-Clal — синтетический линкер. GATCATT GCCCTGAT TAACGGGACTAGC: — генетические маркеры: Ыа — ген, 3-лактамазы; cat — ген хлорамфениколацетилтрансфераэы; — тандем промоторов транскрипции А2 и А3 раннеи области бактериофага Т7. — уникальные сайты рестрикции, расположеные на расстоянии вправо от сайта Kpnl: ВstЕ II — 405 нуклеотидов; Bglll — 492 нуклеотида; Hindlll — 586 нуклеотидов. Рst — 3779 нуклеотидов. 2. Рекомбинантная плаэмидная ДНК рТНУ12 — промежуточный продукт для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рТНУ314. кодирующей поли ептид со свойствами тимоэина а1 челов ха. размером 4,02 т,п.о., содержащая: — HlndlIl - Clal — фрагмент ДНК плаэмиды р С PG2, размером 3,92 т.п.о.; — CIa - Hlndlll — синтетический ген, кодирующий пол ипептид тимозин а1 человека, размером 0,1 т.п.о.: — уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта Bam Hl: Clal 24 нуклеотида; Bgl 11 — 75 нуклеотидов; Hindi ll — 118 нуклеотидов; Ncol — 729 нуклеотидов; Pstl — 2573 нуклеотида; — тандем промоторов транскрипции А2 и А3 ранней области бактериофага Т7, синтетический участок инициации трансляции, терминатор транскрипции фага А; 170 078 Составитель Т.Забойникова Техред М,Моргентал Корректор О.Кундрик Редактор И.Дербак Заказ 242 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 — генетические маркеры: Ыа — ген 9-лактамазы; сат — ген хлорамфениколацетилтрансфераэн. 3. Штамм бактерии Г.,спег1с1i1ч сп0 ВКПМ B-5056 — продуцент полипептида со свойствами тимозина < i челогека.
