Способ хроматографического опредения витамина d @ в кормовых дрожжах

 

Назначение: способ относится к определению витаминов при производстве микробиологическим способом, а точнее к способам определения содержания витамина D2 в биомассе, и может быть использован при производстве дрожжей, обогащенных витамином D2. Навеску дрожжей гидролизуют, экстрагируют гексаном стероидную фракцию, обрабатывают насыщенным раствором иода в гексане до появления розового окрашивания с последующей отгонкой растворителя. Далее сухой остаток смачивают бензолом, добавляют гексан до полного растворения и осуществляют газожидкостную хроматографию на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическую колонку (стеклянную) заполняют хроматоном N Super (0,125...0,160 мм), покрытым силиконовым маслом OV-225 в количестве 5% от массы носителя. Снятие хроматограмм производят при температурах: испарителя 293- 296°С, колонок 280-285°С. 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 30/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4826883/25 (22) 04.04.90 (46) 23.04.92, Бюл, М 15 (71) Научно-производственное объединение Гидролизпром" (72) В.Е.Гаврилов, О.И.Шаповалов, А.И.Орлов, Н.В.Корнилова и О,В.Машкова, (53) 543.544(088,8) (56) Шаповалов О,И, и др. Исследование фотоизомеризации провитамина 02 в биомассе. — Отчет НПО "Гидролизп ром". — Л., 1988, с. 28.

Там же, с. 27. (54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА Dz В КОРМОВЫХ ДРОЖЖАХ (57) Назначение: способ относится к определению витаминов при производстве микробиологическим способом, а точнее к

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам определения витамина Dz в бйомассе, и может быть использовано при производстве дрожжей, обогащенных витаминов 02.

Известен полуколичественный способ определения витамича Dz в кормовых дрожжах методом тонкослойной хроматографии, основанный на определении последнего по интенсивности окраски и величине пятен, полученных на хроматограмме.

Наиболее близким к изобретению является способ хроматографического определения витамина 02, включающий экстрагирование стероидной фракции орга„„Я2„„1728791 А1 способам определения содержания витамина Dz в биомассе, и может быть использован при производстве дрожжей, обогащенных витамином Dz. Навескудрожжей гидролизуют, экстрагируют гексаном стероидную фракцию, обрабатывают насыщенным раствором иода в гексанедо появления розового окрашивания с последующей отгонкой растворителя. Далее сухой остаток смачивают бензолом, добавляют гексан до полного растворения и осуществляют газожидкостную хроматографию на хроматографе с пламенно-ион изационным детектором.

Хроматографическую колонку (стекля н ную) заполняют хроматоном N "Super" (0,125...0,160 мм), покрытым силиконовым маслом OV-225 в количестве 5% от массы носителя. Снятие хроматограмм производят при температурах: испарителя 293296 С, колонок 280 — 2850С. 1 ил, ническим растворителем (серным эфиром), разделение компонентов смеси с помощью тонкослойной хроматографии. По полученным хроматограммам определяют оптическую плотность экстракта, нанесенного на хроматографическую пластинку, соответствующую определенному количеству витамина Dz.

Недостатками этого способа являются его сложность, применение дефицитных реактивов (дигитонин), неселективность.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его селективности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу анализируемые кормовые

1728791

240

55 дрожжи первоначально растворяют в спиртовом растворе щелочи, кипятят и затем гидролизат экстрагируют органическим растворителем. После экстрагирования стероидной фракции осуществляют ее обработку насыщенным раствором иода в гексане до появления розового скрашивания с последующей отгонкой растворителя.

Далее к сухому остатку добавляют до смачивания бензол и гексан до полного растворения. После этого осуществляют газожидкостную хроматографию на хроматографе с пламенно-ионизированн ым детектором.

Хроматографическую колонку (стеклянную) заполняют готовой насадкой-хроматоном N

"Super" (0,125...0,160 мм), модифицированным жидкой фазой — силиконовым маслом

0V-225 в количестве 5/ от массы носителя, Снятие хроматограмм производят при температуре колонок 280 — 285 С.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску сухих дрожжей обрабатывают щелочью, смесь гидролизуют кипячением на водяной бане и экстрагируют гексаном.

Экстракт обрабатывают насыщенным раствором иода в гексане, растворитель отгоняют, добавив несколько капель бензола, сухой остаток растворяют в гексане и раствор анализируют методом газожидкостной хроматографии.

На чертеже представлена хроматограмма анализируемой пробы кормовых дрожжей.

Пример, В пробирку (или термостойкую колбу) вместимостью 25 — 100 см помез щают навеску сухих дрожжей в количестве

1 г и заливают 15 см спиртового раствора гидроокиси калия (12 КОН). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в токе азота в течение 1,5 ч на водяной бане.

Полученный гидролизат охлаждают и переливают в делительную воронку с равным объемом дистиллированной воды, Затем неомыленную стероидную фракцию экстрагируют гексаном 3 раза, добавляя каждый раз по 20 см . Объединенные гексановые вытяжки промывают дистиллированной водой до полного удаления щелочи (отсутствие щелочи проверяют с помощью индикаторной бумаги).

Для определения содержания витамина

Dz в исследуемой пробе в виде трансвитамина к полученному ранее экстракту добавляют по каплям насыщенный раствор иода в гексане до появления устойчивого розового скрашивания. Растворитель отгоняют в токе азота на водяной бане, прибавляют в конце несколько капель бензола (5 — 6 капель), сухой остаток растворяют в гексане

40 до полного растворения и раствор хроматографируют, Х ром ато графическую колон ку (стекл я нную), промытую водой и этиловым спиртом, просушенную в токе воздуха, заполняют готовой насадкой-хроматоном N "Super" (0,125 — 0,160 мм), модифицированным жидкой фазой — силиконовым маслом OV-225 в количестве 5 от массы носителя. Колонку устанавливают в термастат хроматографа, продувают газом-носителем и насыщают ее раствором эргостерина и витамина 02 в гексане (делают 30 — 40 укалываний). После насыщения приступают к определению витамина Dz, предварительно подготовив пробу, Снятие хроматограмм проводят при следующих условиях: температура, С: испарителя 295 колонок 280

Скорость диаграммной ленты, мм/ч

Расход, см /мин; газа-носителя — гелия 60 водорода 30 воздуха 300

Объем вводимой пробы,мкл 5 — 10

На хроматограмме пик характеризует наличие витамина Dg, который после введения дополнительной стадии обработки иодом выходит в виде одного, а не двух пиков. Этот пик соответствует трансвитамину, в который под действием иода переходит витамин Dz. В то же время иод не действует ни на эргостерин, ни на пиро- и изопировитамины, что характеризует надежность и селективность способа.

При помощи предлагаемого способа анализа можно определить степень сохранности витамина Dz при сушке облученной биомассе.

Формула изобретения

Способ хроматографического определения витамина Dz в кормовых дрожжах, включающий экстрагирование стероидной фракции анализируемой пробы органическим растворителем, хроматографическое разделение компонентов экстракта и определение содержания витамина Dz в соответствующей ему хроматографической зоне, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности и упрощения способа, в экстракт стероидной фракции добавляют по каплям насыщенный раствор иода в гексане до появления устойчивого розового окрашивания, отгоняют растворитель, сухой остаток растворяют в гексане и

1728791

ФО iO

50.гО

5!О

50

Составитель В.Агинский

Техред М.Моргентал Корректор С.Шевкун

Редактор H.Ðîãóëè÷

Заказ 1405 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 разделяют на стеклянной колонке с насад- ной нитрилсиликоновым маслом, при 280кой на основе силикагеля, модифицирован- 285 С.