Питательная среда для культивирования francisella тulаrеn sis

 

Использование: микробиология, диагностика туляремии, получение биомассы бактерий. Francisella tularensis. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда состоит из следующих компонентов: забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, ферментолизат черного альбумина , дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В, сернокислый магний, сернокислый натрий, цистеин, глюкоза, агар и дистиллированная вода. Культуры F.tularensis, выращенные на этой среде, типичные по культурально-мбрфологическим свойствам. Среда позволяет упростить и повысить эффективность бактериологических исследований при диагностике туляремии, увеличить выход биомассы при производстве тулляремийных диагностикумов, 1 табл. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4863012/13 (22) 27.06,90 (46) 30.04.92. Бюл. N" 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Л,B.Ëîãà÷åâa, T.Ï.Ìîðoçîâà, В.А.Кундин, И.Ю,Дмитриева и В.И.Артюхин (53) 576.8.093.31(088.8) (56) Appl. microbiol. v,10. 1962, N 1, р.90-92, Appl. microbiol„v.14, 1962, ¹ 5 р.407-.

412.

Appl. microbiol. March. 1965.

Микробиология и иммунология 0 0 И, 1964, с.251 — 153, Авторское свидетельство СССР

N . 1614494, кл, С 12 N 1/20, 1989.

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1969. ¹ 4, с.34-36.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы и при диагностике туляремии, Цель изобретения — повышение ростовых свойств среды и выхода биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что среда, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, глюкозу, агар и дистиллированную воду. дополнительно содержит сернокислый магний и сернистокислый натрий, в качестве питательной основы она содержит забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, рН 6.9-7.2; а в качестве стимуляторов роста — ферментолизат черного альбумина и дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В при следующем соотношении компонентов г/л:

„,!Ж„„1730143 А 1 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ FRANCISELLA TULARENSIS (57) Использование: микробиология, диагностика туляремии, получение биомассы бактерий Franciseila tularensis. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда состоит из следующих компонентов: забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, ферментолизат черного альбумина. дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В, сернокислый магний, сернокислый натрий. цистеин, глюкоза, агар и дистиллированная вода. Культуры

Р tularensis, выращенные на этой среде, типичные по культурально-мОрфологическим свойствам. Среда позволяет упростить и повысить эффективность бактериологических исследований при диагностике туляремии, увеличить выход биомассы при производстве тулляремийных диагностикумов, 1 табл. е

Забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, рН 6,9 — 7,2 16,0-18,0

Ферментолизат черного альбумина 4,0-6,0

Дрожжевой экстракт или1,5 — 2,5 смесь витаминов группыВ 0,014 — 0,018

Сернокислый магний 0,45 — 0,55

Сернистокислый натрий 0,65 — 0,75

Цистеин 0,4-0,6

Глюкоза 2,0 — 11,0

Агар 10,0-12,0

Дистиллированная вода До 1 л причем смесь витаминов содержит тиамин и пантотенат кальция в равных количествах, Пример 1, Приготовления среды производится следующим образом.

1730143

1, Получение гидролизата PC.

Сернокислотный гидролиз рыбной кормовой муки проводят при температуре

131 + 2 С в течение 2 ч, Далее последовательно проводят следующие операции, первичная фильтрация, деионизация, осветление, вторичная фильтрация. В обработанный по этой схеме гидролизат для создания необходимой буферности и осмомолярности вводят минеральные соли: одно- и двузамещенные фосфаты калия, хлористый натрий, Гидролизат прогревают, фильтруют, устанавливают значение рН 7,2 и 2,0 и сушат в распылительной сушилке.

2. Получение стимулятора роста (СР ГМ), Ферментолиз черного альбумина проводят протосубтилином Г 10 Х, Г 3 Х при температуре 50 +.2 С в течение 40 мин.

Затем реакционную смесь прогревают при

120 С + 2 С в течение 30 мин, охлаждают до 60 — 70 С, фильтруют и сушат на распылительной сушилке.

3, Для определения оптимальных концентраций ингредиентов готовят питательную среду следующего компонентного состава, г/л:

Гидролизат PC 16,0

СРГМ 2.0

Цистеин 0,4

Дрожжевой экстракт 1.5

Смесь витаминов 0,014

Глюкоза 2.0

Mg SO4 7Н20 0.45

МагЯОз 0.65

Агар 10,0

Дистиллированная вода До 1 л растворяют в дистиллированной воде и кипятят 10 — 15мин, не допуская пригорания.

Среды охлаждают до 45 — 50 С и вводят факторы селективности. мг/л:

Кефзол 10 или цефалексин 20

Амфотеррицин 10

Амфогл юкамин 40

Ристомицин 40

Факторы селективности вводят во Все среды, стерилизуемые кипячением, а также в случае приготовления селективных вариантов. При стерилизации автоклавированием среда нагревается до расплавления агара и стерилизуется при 110 С в течение

30 мин.

Пример 2. Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении ингредиентов, г/л;

Гидролизат PC 18,0

СРГМ 6,0

Цистеин 0,6

ДЭ или 2,5 смесь витаминов 0,018

Глюкоза 11,0

MgS04 7НгО 0,55

5 Наг ЯОз 0,75

Агар 12,0

Дистиллированная вода До1л

Пример 3, Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении

10 компонентов, г/л:

Гидролизат PC 17,0

СРГМ 5,0

Цистеин 0,5

ДЭ или 2,0

15 смесь витаминов 0,016

Глюкоза 5,0

MgSO4 7Н20 0,5

Ма2$0з 0,7

Агар 11,0

20 Дистиллированная вода До 1л

Для удобства применения, транспортирования, а также с целью стандартизации среды разработан вариант сухой питательной среды предлагаемого состава, 25 П р и м е. р 4, Для получения 1 кг сухой питательной среды необходимо смешать в смесителе барабанного типа ингредиенты среды в количестве, r:

Гидролизат PC 383,0

30 СРГМ 106,5

ДЭ или 42,6 смесь витаминов 0,340

Цистеин 10,7

Глюкоза 213,0

MgS04 7Н20 10,7

NazSOa 14,9

Агар 234,3

Сухую среду расфасовывают в соответствующую тару, герметично упаковывают и

40 хранят в сухом месте при температуре не выше 35 С.

Для приготовления 1 л питательной среды, необходимо 47 г порошка тщательно размешать в 1000 мл дистиллированной воды, 45 простерилизовать по примеру 1 и разлить в чашки Петри, пробирки, матрацы.

Пример 5. Экспериментальная проверка ростовых свойств среды.

В качестве тест-штаммов используют

50 вакцинный штамм N 15 НИИЭГ и вирулентный N 503 Р tularensis. В качестве среды сравнения (контроля) используют известную среду. Проверку ростовых свойств среды проводят, определяя следующие

55 показатели: чувствительность среды (минимальна посевная доза, вызывающая рост тест-штаммов); показатель прорастания (процентное отношение числа колоний, сформировавшихся на испытуемой среде, к

1730143

1,5 — 2,5

50 числу таковых на контроле); скорость роста (время появления типичных колоний): продуктивность среды (выход биомассы с 1 мл среды).

Для определeHèÿ эти показателей испол зуют инокуляты из 2-суточных культур тест-штаммов, выращенных на среде МакКая. Посевной материал, содержащий

5 . 10,50,500м.к,/мл, готовятпостандарту

6 мутности ГИСК на 10 ед. путем десятикратных разведений в физиологическом растворе.

Для определения чувствительности, показатели прорастания, скорости роста взвеси тест-штаммов с концентрацией 50 и

500 м.к./мл высевают на 5 агаровых пластин с вариантами сред N 1.2.3.4 и контролем по 0,1 мл на каждую.

В таблице приведены ростовые свойства питательных сред, полученных согласно примерам.

Из представленных данных видно, что предлагаемая среда для диагностики туляремии отвечает требованиям, предьявляемым к этим средам. Культуры F tularensis, получаемые на этой среде. типичны по культурально-морфологическим свойствам.

Для определения продуктивности среды засевают 5 пробирок со скошенным агаром 0,2 мл взвеси с концентраций

5 10 кл/мл и инкубируют посевы при

37 С в течение 48 ч. О п родукти вности судят по количеству жизнеспособных клеток в полученной биомассе, Из полученных данных следует, что продуктивность предлагаемой среды находится на уровне 35 10 кл/мл, что в 1.5 раза превышает продуктивность известной среды.

Использование среды позволяет при упрощении технологии приготовления повысить эффективность бактериологических исследовании при диагностике турялемии, увеличить выход биомассы при производств туляремийных диагностикумов, а также отказаться or использования крови в пита5 тельных средах. сЬормула изобретения

Питательная среда для культивирования Francisella tularensis. содержащая пита10 тельную основу, стимуляторы роста. цистеин. глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды и выхо да биомассы, она дополнительно содержит

15 сернокислый магний и сернистокислый натрий. в качестве питательной основы она содержит эабуференный гидролизаг р :бной кормовой муки, рН 6,9 — 7,2, а в качеств;-. стимуля- oðΠроста - ферментолизат черно20 го aëüáóìèHa и дрожжевой экстракт или смесь oèTaMYiHQB группы B при следуюше 1 соотношении компонентов, г/л:

Забуференный гидролизат рыбной кормовой

25, муки, рН 6,9 — 7,2 16,0 — 18,0 ц-:ерментолизат черного альбумина 4,0-6,0

Дрожжевой экстракт или

30 смесь витаминов груп- . пы В 0,014 — 0,018

Сернокислый магний 0,45-0,55

Сернистокислый натрий 0,65 — 0.75

Цистеин 0.4-0,6

35 Глюкоза 2,0 — 11,0

Агар 10,0-12,0

Дистиллированная. вода До 1 л

2. Питательная среда по п,1, о т л и ч а ющ а я с я тем, что смесь витаминов содержит

40 тиамин и пантотеяат кальция в paBHbix количествах.

1730143 о с о

Y х

5 м

Ю „, S

IX

X

Ф

CD о 5

a <

>5 а 5 о * Э.

Ф а

СЧ и Н, <О

lD,, м Н о и Н 11 о

g -Н -Н Ф . LA

Е

1 о о

-0 с

CD

Ф о

Ф л т

5

Щ

Iо

CD а о а с с

Q)

IЩ

Ф

Я о

IS рС а.

CLI

Б

S а с о с

С 3 м сч с-> .Н Н .Н Н Н дe СО

С 4 N N М O

rr сг м м

Н Н Н Н

- О ID 4. и ) O

СЧ N N O