Способ получения эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 @ - tgatca-3 @

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является увеличение выхода и повышение активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве штамма - продуцента Bacillus stearothermophilus(BKnM B-5209), имеющего легко разрушаемые ультразвуком бактериальные стенки и содержащего только одну рестриктазу, что позволяет увеличить выход целевого фермента в 1,5 раза, облегчить выделение и очистку фермента. Выход фермента 65000 ед./r биомассы, активность 15 ед./мкл. Рестриктаза Bst 77, полученная по предлагаемому .способу, является изошизомером Bel I и может полностью заменить ее во всех генно-инженерных работах. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4804871/13 (22) 23.03.90 (46) 07.04.92. Бюл. N. 13 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.Е.Репин, И,С.Андреева. А,А.Сизов и В.В.Хомов

j53) 577.15 (088.8) (56) Blolabs, — Catalog, 1986-1987.

Lieger M., Patillon M., Roizes G„Lегоuge

Т., Dupret D., Jeltsch 1.M. Two restriction

endonucieases from Bacillus sphaericus Bsp

Xl and Bsp XII.— Nucl. Acids Res., 1987, ч, 15, N.9, р. 3919.

Bingham А.Н.А., Atkinson Т., Sciaky D., Roberts R.l. А specific endonuclease from

Вас(!Ьз caldolyticus.— Nucl. Acids Res,, 1978, ч. 5, N,10, р, 3457-3467. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕА-.

ЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

НУКЛЕОТИДОВ 5 -TGATCA-3

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается получения сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5"-TGATCA-3 .

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов, расширяет возможность конструирования гибридных молекул по сайту, имеющему в своей основе широко распространенный тетрануклеотид 5 -САТС-3 .

» Я2 1724689 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является увеличение выхода и повышение активности целевого продукта, Способ предусматривает использование в качестве штамма — и родуцента 8 acillu s

stearothermophilus (BKllM В-5209), имеющего легко разрушаемые ультразвуком бактериальные стенки и содержащего только одну рестриктазу, что позволяет увеличить выход целевого фермента в 1,5 раза, облегчить выделение и очистку фермента. Выход фермента 65000 ед./г биомассы, активность

15 ед./мкл. Рестриктаза Bst 77, полученная по предлагаемому. способу, является изошизомером Bcl 1 и может полностью заменить ее во всех генно-инженерных работах. фь

Известен способ получения рестриктаз О

Bst 61 (сайт узнавания 5 -TGATCA-3 ) и Bst ()р

6И (сайт узнавания 5 -ССА/Т66-3) из штамма Bacillus stearothermophilus G3.

Недостатком данного способа является наличие двух активностей, что затрудняет получение чистого фермента, узнающего и расщепляющего последовательность нуклеотидов 5 -TGATCA-3 . !

Известен способ получения рестриктазы Взр ХП (сайт узнавания 5 -TGATCA-3 ) и

Bsp XI (сайт узнавания 5-ATCGAT-3 ), включающий в себя культивирование штамма

1724689

Bacillus sphaericus, хроматографические стадии очистки.

Недостатком данного способа является невысокий выход фермента Bsp XII, который составляет приблизительно 40000 ед,/г сырой биомассы. Кроме того, наличие двух ферментов усложняет процедуру очистки и получения целевой рестриктазы без интерферирующего загрязнения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения рестриктазы Bcl I, узнающей и расщепляющей сайт 5 TGATCA-3, включающий в себя использован ие штамма — и родуцента Bacillus

caldolyticus, культивирование его для получения биомассы, многократную дезинтеграцию биомассы, выделение и очистку рестриктазы хроматографическим способом.

Недостатками известного способа являются низкий выход целевого фермента (40000 ед,/г сырой. биомассы) и низкая активность фермента (1 ед./мкл), а также прочность клеточной стенки штамма затрудняет разрушение биомассы и требует многократной дезинтеграции. (елью изобретения является увеличение выхода и активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения рестриктазы в качестве продуцента используют штамм

Baciilus stearothermophilus (ВКПМ 8-5209), Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов биологически активных веществ.

Полученный штамм Bacillus

stearothermophilus депонирован в ВКПМ

ВНИИгенетики под регистрационным номером В-5209, а продуцируемая им рестриктаза названа Bst 77 l согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus stearothermophiius характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые или слегка изогнутые (0,5-0,75) х (2-14) мкм, подвижные, Образуют эндоспоры овальной формы, терминального расположения, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму вариабельная.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах(СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие круглые, непигментированные колонии, прозрачные, блестящие, с ровным краем. Оптимальная температура роста 65 С, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70 С или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе, в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет при концентрации NaCI 5 и 0,001 лизоцима: энергично образует кислоту иэ глюкозы, очень слабо — из арабинозы, ксилозы и маннита; не дезаминирует фенилаланин, не выделяет индол и сероводород.

Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину, гентамицину, метициллину, сульфатиазолу, линкомицину; менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину, олеандомицину, левомицетину, канамицину, ристомицину, рифампицину; слабо чувствителен к полимиксину; устойчив к стрептомицину, Для культивирования Bacillus

stearothermophilus В-5209 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт ("Difco") 5; глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65ОС и интенсивной аэрации до достижения стационарной фазы роста.

Выход целевого фермента 65000 ед./r сырой биомассы с активностью 15 ед./мкл.

Отличием предлагаемого способа от известного является использование нового более продуктивного штамма Bacillus

stearothermophiius, превышающего по выходу известный более, чем в 1,5 раза, с более высокой активностью выделяемого целевого фермента, способностью легко лизироваться. при ультразвуковой дезинтеграции, Пример, Штамм выращивают в питательной среде следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5 ("Difco"); глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65 С с аэрацией 2 об./мин, а при перемешивании

150 об/мин до стационарной фазы роста.

Клетки собирают центрифугированием при

5000 g и температуре 4 С.

Биомассу весом 5 г загружают в стеклянный химический стакан, добавляют 10 мл 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 1 MM ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол (буфер А) с добавлением 0;4 M хлористого натрия, перемешивают при помощи магнитной мешалки до получения гомоген1724689

Составитель B. Репин

Редактор И. Дербак Техред М,Моргентал Корректор M. Шароши

Заказ 1150 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ной суспензии. добавляют 6 мг лиэоцима и перемешивают в течение 30 мин.

Суспензию разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе на резонансной частоте 22 кГц. 5

Озвученную суспензию переносят в стакан, содержащий 50 мл ПЭ Г-6000 (11,2 $) и декстран Г-500 (3,5$), помещают на магнитную мешалку и при постоянном перемешивании добавляют 4М раствор NaCI до .10 конечной концентрации 0,5 M. Смесь перемешивают в течение 5 мин, Для разделения фаз суспенэию центрифугируют на центрифуге G-21 при 20000 об/мин в течение 10 мин. Полученный гру- 15 бый экстракт (25 мл) разбавляют в два раза буфером А и наносят на колонку с гидроксилапатитом объемом 25 мл. Примесные белки удаляют промыванием буфером А, содержащим 0,2 М Nacl. Элюцию фермента прово- 20 дят линейным градиентом NaCI 0,01 — 0,25 М концентрации буфером А. Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, фер-. мент разбавляют в 1,5 раза 20 мМ трис-НО (рН 7,5), содержащим 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 25

2-меркаптоэтанол, 10 -ный глицерин (буфер B).è наносят на колонку с гепарин-сефарозой 4В объемом 30 мл. Примесные белки .удаляют промыванием буфером В, содержащим 0,2 М йаС!. Фермент элюируют линей- 30 ным градиентом 0,2-1,0 M NaCI в буфере B.

Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и диализируют против 50 MM трис-HCI (рН 7,9), содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол. 0,02 -ный тритон 35

Х-100, 60 Р-ный глицерин.

Выход фермента 65000 ед.акт./г сырой биомассы, активность 15 ед./мкл. Препарат не содержит примесей эндонуклеаз. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 37 С.

Предлагаемый способ по.сравнению с известным обеспечивает повышенный вы ход целевого фермента (более, чем в 1,5 раза), облегчает выделение и очистку фермента от интерферирующей рестриктаэной активности, поскольку используемый штамм продуцирует только одну рестриктаэу, позволяет повысить активность рестриктазы более, чем в 10 раэ, а также облегчает разрушение клеточных стенок бактерий при ультразвуковой дезинтеграции.

Поскольку рестриктаза Bst 77 I имеет сайт узнавания 5 -TGATCA-3, идентичный сайту узнавания рестриктаэы Bcl I, она может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Способ получения. эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5-TGATCA-3, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Bacillus, дезинтеграцию биомассы, выделение и хроматографическую очистку фермента, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Bacillus stearothermophilus 8КПМ B5209.