Способ получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов

 

Использование: биотехнология, медицина , способы иммобилизации ферментов. Сущность изобретения: раствор восстановленного кератина и ферментавысаждают диспергированием .в смесь вода:этанол:сульфат аммония 6,0:1,5-2.0:1,0-1,1. Гранулы промывают водой и обрабатывают смесью вода:сульфат аммония:формальдегид 30,0:5,0:1,0-3,0 в течение 3-4 ч при рН 7.0-7,5. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 11/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4802442/13 (22) 26,01.90 (46) 30.04.92. Бюл. М 16 (71) Научно-производственное объединение

"Пластмассы" и Научно-производственный кооператив "Химия" . (72) Ю,Л.Кульчицкий, В.Д.Горчаков и

А.В.Ананичев (53) 577.15.07 (088.8) (56) Иммобилиэованные ферменты. Под ред.

И.В.Березина, К.Мартинек. М,: МГУ, 1976;

KIkkawa M.Ê., Sugiura М., Togoda Н., А

New Approach to Enzynu Immobilizaton in

KeratIne GeI. Hikaki Kagaku, 1978. 24(2), 103108.

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению гранулированных. нерастворимых форм иммобилизованных ферментов (биокатализаторов) на основе природного биополимера-кератина, которые могут найти широкое применение в биотехнологии. медицине и биологии.

Известен способ получения биокатализаторов на основе иммобилиэованных ферментов их реакцией no SH-связям с раствором восстановленного меркаптоэтанолом кератина с последующим диспергированием с образованием хлопьевидного . продукта.

Недостатком известного способа является низкая механическая прочность иммобилизованного продукта, что затрудняет его практическое использование.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов высаждением

„„5U„, 1730147 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ (57) Использование: биотехнология, медицина, способы иммобилизации ферментов, Сущность изобретения: раствор восстановленного кератина и фермента высаждают диспергированием .в смесь вода:этанол:сульфат аммония: 6,0:1,5 — 2,0:1,0 — 1,1.

Гранулы промывают водой и обрабатывают смесью вода:сульфат аммония:формальдегид 30,0:5,0:1,0 — 3,0 в течение 3 — 4 ч при рН

7.0 — 7,5. 1 табл, восстановленного по SH-связям кератина и фермента из водного раствора путем сушки при комнатной темпЕратуре с последующей обработкой полученных пленок глубаровым альдегидом при комнатной температуре и рН 8 — 9 в течение 5 — 6ч.

Недостатками данного способа являются невозможность получения продукта в виде гранул, что обуславливает плохие гидродинамические свойства и затрудняет его применение в колоночных сорбционных процессах, а также крайне низкая механическая прочность полученных пленок, которую невозможно определить известными методами.

Цель изобретения -улучшение гидродинамических свойств биокатализатора.

Поставленная цель достйгается тем, что раствор восстановленного кератина и фермента высаждают при диспергировании в смесь, состоящую иэ воды, этанола и сульфата аммония, взятых в массовом соотношении 6,0:1,5-2,0:1,0-1,1 соответственно, и

1730147 дальнейшую обработку проводят альдегидсодержащим соединением при рН 7,0 — 7,5 в течение 3 — 4 ч, а в качестве альдегидсодержащего соединения используют смесь вода:сульфат аммония:формэльдегид в массовом соотношении 30.0:5.0:1,0 — 3.0 соответственно.

Это позволяет получать нерастворимые формы иммобилизованных ферментов с улучшенными гидродинамическими свойствами за счет получения продукта в виде гранул правильной сферической формы с высокой механической прочностью (разрушающее напряжение 0,126-0,136 кг). Это дает воэможность эффективно использовать биокатализаторы B колоночных сорбционных процессах.

Одновременно решается задача утилизации крупнотоннажных отходов птицеперерабатывающей промышленности, так как исходным сырьем для получения растворов восстанновпенного кератина по стандартному способу являются сырье перопуховое (ОСТ 10-02-01-06-87), запасы которого являются возобновляемыми и практически неограниченными, утилизация которых представляет собой серьезную народнохо, зяйственную проблему.

Использование при высаждении диспергированием смеси вода:этанол:сульфат аммония, содержащей нэ 6,0 ч. воды менее

1,5 ч, этанола и менее 1.0 ч. сульфата аммония, а также более 2.0 ч, этанола и 1,1 ч. сульфата аммония, не позволяет получить гранулы правильной сферической формы и ведет к образованию агрегатов денатурированного белка неправильной формы.

Использование для обработки смеси вода:сульфат аммония:формальдегид, содержащий менее 5,0 ч. сульфата аммония и менее 1,0 ч, формальдегида, не позволяет достичь высокой механической прочности гранул, а увеличение содержания сульфата аммония более 5,0 ч. и формальдегидэ более 3,0 ч. приводит к снижению активности иммобилизован ного фермента.

Проведение реакции при рН ниже 7 0, а также выше 7,5 не позволяет получить гранулы с высокой механической прочностью.

При обработке гранул реакционной смесью менее 3 ч не достигается высокая механическая прочность продукта, Время обработки более 4 ч. нецелесообразно, так как не приводит к существенному улучшению свойств конечного продукта, Пример 1. К 25 мл раствора восстановленного кератина добавляют при перемешивании 3.69 мл 2 M раствора (МН4) ЗОВ, содержащего 0,1 г лактатдегидрогеназы с активностью 200 ФЕ/мг.

Проводят высаждение белка при диспергировании в 100 г высадительной смеси, содержащей воду, этэнол и сульфат аммония в массовом соотношении 6,0;1,5:1,0 соответственно. Образовавшиеся гранулы промывают водой и обрабатывают 100 r реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формэльдегид при массовом соотношении компонентов

30,0:5,0:1,0 соответственно, при рН 7,0 в течение 3 ч, затем промывают. водой. Диа10 метр гранул 2,0 мм; лактатдегидрогеназа сохраняет 88,5% исходной активности.

Характеристики процесса и полученного продукта представлены в таблице.

Пример 2. Смешение компонентов и высаждение белка при диспергировании проводят аналогично примеру 1. Образовавш иеся гранул ы обрабатывают 1 00 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом со20 отношении компонентов 30,0:5,0;1,0 соответственно, при рН 7,0 в течение 4 ч, затем промывают водой. Диаметр гранул 1,8 мм.

Лактатдегидрогеназа сохраняет 82,3% исходной активности, Пример 3. Получение продукта и его обработку реакционной смесью ведут ана25 логично примерам 1 и 2, но при рН 7,5

Диаметр гранул 1,82 мм. Лактатдегидроге30 наза сохраняет 84% исходной активности.

Пример 4. К 25 мл раствора восстановленного кератина добавляют при передиспергировании в 100 г - высадительной смеси, содержащей воду, этанол и сульфат аммония в массовом соотношении компонентов 6,0:1,5:1,0 соответственно. Гранулы промывают водой и обрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом

40 соотношении компонентов 30,0:5.0:3,0 со- . ответственно, при рН 7,2 в течение 3 ч, затем промывают. водой. Диаметр гранул 1,68 мм. Уреаза сохраняет 62,5% исходной активности.

Пример 5, К 25 мл раствора восста-. новленного кератина добавляют при пере45

50 мешивании 0,01 г уреазы с активностью 724

ФЕ/мг. Проводят высаждение белка при диспергировании в 100 г высадительной смеси, содержащей воду, этанол и сульфат аммония при массовом соотношении компонентов 6,0:2;0:1,1 соответственно, Гранулы промывают водой и обрабатывают 100 r реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и формальдегид при массовом соотношении компонентов

30,0:0,2:2,0 соответственно, при рН 7,0 в мешивании 0,01 г уреазы с активностью 724

35 ФЕ/мг. Проводят высаждение белка при 1730147 течение 3,5 ч, затем промывают водой. Уреаза сохраняет 64,0 исходной активности.

Диаметр гранул 1,70 мм.

Пример 6. Получение гранул проводят аналогично примеру 5. Гранулы обрабаты- 5 вают реакционной смесью, содержащей воду, сульфата аммония и формальдегид при массовом сботношении компонентов

30,0:5,0;3,0 соответственно, при, рН 7,5 в течение 4 ч. 10

Диаметр гранул 1.60 мм. Уреаза сохраняет 60,2 исходной активности.

Пример 7. К 25 мл раствора восстановленного кератина концентрацией 12,57ь при перемешивании добавляют 0,1 r фер- 15 ментного препарата глюкозоизомеразы из

Str. rubiginousus "Cyomen Cokepn" (Фин- . ляндия), активностью 2820 ед/г. Проводят высаждение при диспергировэнии в 100 r высадительной смеси, содержащей воду, 20 зтанол и сульфат аммония в массовом. соотношении 6,0:1,5:1,0 соответственно, Обра.зовавшиеся гранулы промывают водой и обрабатывают 100 г реакционной смеси, содержащей воду, сульфат аммония и фор- 25 мальдегид при массовом соотношении компонентов 30,0:5,0:1 0 соответственно, при рН 7,0 в течение 3,0 ч, затем промывают водой. Диаметр гранул 2,0 мм, глюкозоизомераза сохраняет 72 активности, разру- 30 шающее напряжение 0,126 кг.

Пример 8, К 25 мл раствора восстановленного кератина. концентрацией 12,0% при перемешивании добавляют 0,01 г глюкозооксидазы активностью 118,700 ед. Да- 35 лее процесс идет по примеру 7. .Диаметр гранул 2,0 мм,. глюкозооксидаза сохраняет 64 активности, разрушающее напряжение 0.126 кг.

Пример ы 9 — 12 (сравнительные). 40

Процессы проводят аналогично примеру 1, соотношение компонентов высадительной и реакционной смеси, технологический режим процесса и свойства продуктов представлены в таблице, 45

Как видно из данных таблицы, предлагаемый способ позволяет получать биокатализаторы с улучшенными по сравнению с известными способами гидродинамическими свойствами за счет получения конечного продукта в виде гранул правильной сферической формы с высокой механической прочностью (разрушающее напряжение

0,126 — 0,136 кг).

Биокатализаторы, полученные по предлагаемому способу, в колоночныхсорбционных режимах позволяют значительно повысить удельную нагрузку на препарат (более чем в 3 раза по сравнению с известными способами), что в свою очередь прямо пропорционально продуктивности биокатализатора, Предлагаемый способ позволяет сохранять высокую активность иммобилизованного фермента. Способ является технологичным, продукт может выпускатьса на серийном оборудовании. Предлагаемый способ дает возможность технологически просто утилизировать отходы птицеперерабатывающей промышленности.

Формула изобретения

Способ получения биокатализаторов нэ основе иммобилизованных ферментов путем высаждения смеси восстановленного кератина и фермента из водного раствора с последующей обработкой альдегидсодержащим соединением при комнатной температуре,отличаю щийаятем,что,сцелью улучшения гидродинамических свойств биокатализаторов, высаждение осуществляют диспергированием в смесь, состоящую из воды. зтанола и сульфата аммония при массовом соотношении 6,0;1.5 — 2:1,0-1,1 соответственно, обработку альдегидсодержэщим соединением проводят при рН 7 0—

7,5 в течение 3-4 ч, а в качестве альдегидсодержащего соединения используют смесь вода:сульфат аммония:формальдегид в массовом соотношении

30,0:5,0:1,0-3,0 соответственно, 1730147

Технологический ремни процесса и сеойстал лродуктоа

I I

I Соотномение Соотноаение рН коипонентое; коипонемтоа ре»

llpwep

Сохранение актианости ферменте, 8 емсадительной акц. смеси еосмеси вода; да:сульфат анэтанолгсуль- ионнятформальдеФат аммония гид

5.9

Г ;%

6,0:1!5>1,0 30>0 5 ° 0.1,0 7,0

3 88 ° 5

2,0 0,126

6,0:1,5>1,0 30,0:5,0>1,0

6,0:1,5 .1,0 30,0:5>0:1,0

6,0: l>5>1,0 30,0:5,0;3,0

4 82,3. 84,0

3 62,5

То хе

»

Уреааа 724

6 7

1,70 0,129 .

1,60 0,36

3,5 64,0

4 60,2

То ие

»

Глокозонзо" нераза 2 ° 82

6,0:1,5>1,0 30,0:5,0:1,0 7,3 3 72

6,93

83Г

2.0 . 0,126

Гпюкозооксндаза 118,7

2,0 О, 126

6,0:1,5;1,0 30,0:5,,0:1,0

3 64

7,0

Лахтатдегилрогеназа

2 85,2

6,0:1 0 0 5 30,0:5,0:1,0

6,0

6,0:3,0;2,5 30:5,0:1 ° 0

5 84,3 .

10 То же

Продукт непраеильной форин

6,0:3,0:2,5 30,0:5 В:5,0

7,2 5 34,2

Гранул . нет

2,15. 0;051

6,0:1,5: 1,0 30,0:3,0:0,5

6,5 53 83,3

Лактатдегндрогеназа

Уреаза 751

2,34

1 VJ

1 0 числителе,указана ееличннз после 5 ч испытаний, е значенателе - после 120 ч.

Составитель Ю,Кульчицкий

Редактор М.петрова Техред М.Моргентал Корректор В>Гирняк

Заказ 1489 Тираж Подписное .

ВНИИПИ Г

И Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина 101

12

Прототипп фориарит, актиеность, Ф(/мг

Лактадегнд рогеназа

200

6,0:2,0:1,1

6,0:2,0:1,1

30 ° О:5,0:2,0

30,0>5,0:3,0

7,4

7,5

7,2

7,0

7,5

Spew обработки, .ч

Степень разложения 592

Раздумал>цее напал

l кение, kl

Диаметр лолученнмх гранул, ии

1,8

1,82

1,68

0,128

0>126

0,126

Продукт непраеильной форин

Удельная на» грузна на биокатализаторз нл/мл б.к.ч