Способ определения количества живых клеток в биопрепаратах

 

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: определяют дзета-потенциал нативной и полностью инактивированной культур. Строят кривую зависимости числа живых клеток от величины дзета-потенциала. Определяют количество живых клеток по кривой. При этом сокращается время и повышается точность определения. 2 табл. 2 фиг, (/) С VI со ел GJ ,0 VI

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 1/00, С 12 Q 1/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 4 ,(л) (Л

,(л)

iQl

: 3

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4783437/13 (22) 16,01.90 (46) 23.05.92. 6юл. N . 19 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) Ю.В.Медведев, Т,Ф.Гирфанова, Е.П.Кознева и Ю.М.Чернобережский (53) 576.8.078(088.8) (56) 1. Методы общей бактериологии, Под ред. Ф.Герхарда. — M. Мир, 1983, т. 1, с, 450-464.

2. Calcott, Macleod R.À. The aurviral of

Е.colifrom freezethaw damage: permeability

Barrier damage and viability

Can.J,Microbiol., 1975, ч.21, р.1724-1732.

3. Strange R.F. Induced enzyme synthesis

in aqueous suspensions of stored stationary

phase aегоbacter aегоgenes — Nature, London, 1961, ч, 191, р. 1272-1273, 4. Авторское свидетельство СССР

¹ 857262, кл. С 12 N 1/00, 1979, 5. Авторское свидетельство СССР

¹ 1458389, кл. С 12 N 1/00, 1986.

6. Духин С.С. и Дерягин Б,В. Электрофорез. — М.: Наука, 1976, 328 с.

7. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. — Л.: Химия, 1974, 352 с, 8. Работнова Н.Л, Физиологическая изменчивость микроорганизмов и ее регулирование. — Успехи микробиологии, 1975, т.10, с. 120-131.

Изобретение относится к прикладной микробиологии, а именно к способам анализа микроорганизмов.

Как известно, для определения живых клеток в биопрепаратах применяют такие

„„Я „„1735357 А1

9. Тимаков В,Д, и Гольдфарб Д.М, Успе-., хи экспериментальной медицинской бактериологии. — М.: Медгиз,.1958, 348 с.

10, Кульский Л.А., Дейнека Д.Ф., Ульберг Э.P.. Савчук О.С., Марочко Л,Г. и Демьяненко А,П. Электроповерхностные свойства микробиологических объектов в растворах электролитов. — Коллоид. ж., 1980, т. 42. № 4, с. 755-758.

11. Гузев В,С, и Звягинцев Д.Г. Электро кинетические свойства клеток микроорганизмов и их систематика, — Микробиол., 1973, т.42, N. 6, с. 708-711.

12, Harden V.P, and Harris J,O. The

isoelectric point of bacterial cell.

J.Bacteriol., 1953, н. 65, N 2, р. 198-201.

13. Beavan М,J„Belk D.М. and Stowart

G.G. Changes in electrophoreric mobility and

lytic enzume activity associated with,:.

development of floculating ability in, saccharomices cerevisis.— Can, J. 1979, ч, 25, N8,,р. 888-895, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ КЛЕТОК В БИОПРЕПАРАТАХ (57) Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: определяют дзета-потенциал нативной и полностью инактивированной культур.

Строят кривую зависимости числа живых клеток от величины дзета-потенциала. Определяют количество живых клеток по кривой, При этом сокращается время и повышается точность определения. 2 табл. 2 фиг, методы, как высев на чашках Петри, определение количества живых клеток по изменению содержания различных внутриклеточн ых компонентов (ферментов, структурных компонентов клеточной МеМ61735357 раны, концентрации калия в надосадочной жидкости), появляющихся в среде после гибели клетки и т,д. (1-4).

Недостатками известных способов являются низкая точность, необходимость сложной аппаратуры и длительность определений.

Наиболее близким к предлагаемому способу является физико-химический метод (5), заключающийся в том, что точность и достоверность определения жизнеспособности микробных клеток повышается за счет стабилизации условий роста колоний.

Уравнивание условий их образования одиночными клетками достигается тем, что плотные питательные среды, на которые наносятся для высева суспензии микроорганизмов, заземляют, что обеспечивает снятие возникающего при распределении влаги между пробой и средой электрического заряда. В качестве анализируемого параметра берется колон иеобразующая способность. Точность метода составляет приблизительно 307,.

Недостатком прототипа является длительностьь эксперимента (16-48 ч), Целью изобретения является разработка способа анализа, превосходящего по точности прототип и отличающегося меньшей длительностью.

Указанная цель достигается тем, что в качестве параметра, определяющего состояние клетки, измеряют электрокинетические потенциалы.

Анализ проводят следующим образом, Определяют дзета-потенциалы нативной (p<>) и полностью инактивированной культур (рм ) и определяют число живых клеток по предварительно построенной кривой зависимости числа живых клеток от параметра в=ф-, где h — разность дзета-потенциалов нативной культуры в момент времени с(р ) и полностью инактивированной культуры (pM ):

Лр =Ар при t=0, Определение дзета-потенциала клеток проводят методом микроэлектрофореза (6), Суспензию клеток помещают в видоизмененную ячейку Абрамсона, представляющую собой плоскопараллельный капилляр, на концах которого находятся емкости с обратимыми Cu=CuS04-электродами и агаровыми пробками. Наблюдение за движением клетки ведут с помощью микрОскопа "Биолар" (увеличение 300) в темном поле, Для определения истинной электрофоретиче35

45 личия между этими потенциалами с их выживаемостью, Пример 1. Культура Е.coll штамм М-17, выращенная на глюкозоминеральной среде, инактивировалась в результате хране50 ния, Хранение осуществлялось при 20 +. 2 и

4 + 1 С в течение 16 сут. На разных этапах хранения одновременно с измерением дзета-.потенциала определялась их биологическая концентрация, В табл. 1 приведены

55 усредненные значения исследованных параметров для биологических и физико-химических свойств клеток.

По методу наименьших квадратов был проведен расчет коэффициентов уравнения

60 линейной регрессии, при этом были исполь5

30 ской скорости клеток все измерения проводят на 1/5 глубины ячейки (6). Время (t) прохождения клеткой определенного расстояния (h) под действием постоянного электрического поля измеряют электронным секундомером СТЦ-1, после чего переключателем меняют направление тока на противоположное и снова фиксируют время. Такие измерения проводятся не менее чем для 100 клеток. Напряжение на ячейку подается с помощью блока питания УИП-1 так, чтобы градиент электрического поля составлял 600-700 В/м. Величину тока и напряжение в цепи регистрируют цифровым вольтамперметром ВК-2-20, а электропроводность суспензии измеряют по обычной методике на переменном токе в специальной ячейке с платиновыми электродами с помощью моста емкостей Е8-2, Дзета-потенциал клеток рассчитывают по формуле

Гельмгольца-Смолуховского (7)

4 шдlch Я (f)

D1t где ц — вязкость раствора; к — удельная электропроводность суспензии клеток;

S — площадь поперечного сечения ячейки;

Π— диэлектрическая постоянная среды;

1 — сила тока в ячейке;

h — расстояние, проходимое клеткой за время т.

Измерения электрофоретической подвижности использовались ранее для определения видовой принадлежности микроорганизмов (8 и 9) и определения их электроповерхностн ых свойств (10-13).

Существенность отличий предлагаемого способа от известных заключается в том, что авторами впервые было установлено наличие разницы в дзета-потенциале между живыми и мертвыми культурами и связь раз1735357

55 зованы экспериментальные значения, приведенные в табл, 1 (БК х10, -р). Анализ полученных результатов показывает, что между выживаемостью и величиной дзетапотенциалов клеток существует линейная зависимость с коэффициентом корреляции

0,996. Коэффициент корреляции рассчитывался по формуле

Тг (4 — ь х БК вЂ” БК P 2 (,Я (« — 4) ) (,, (БК1 — БК ) где Т вЂ” коэффициент корреляции;

БК и (- средние значения соответствующих величин.

Выявленная линейная корреляция между дзета-потенциалом и Б К и редстаеляет не только научный, но и практический интерес, поскольку на основании данных по электрофоретической подвижности клеток появляется возможность оценивать их биологическую активность. Учитывая простоту и большую скорость измерения, метод микроэлектрофореза в ряде случаев может заменить более трудоемкий традиционный способ определения биологической концентрации клеток — высев на твердые питательные среды и подсчет колониеобразующих единиц.

Пример 2. Из данных табл. 1 строится калибровочный график БKt/БКо от 0(см. фиг. 1). Этот график может быть использован для определения БК по измерению дзета-потенциала клеток. Например, дзета-потенциал и БК нативной культуры составляют 25,4 мВ и 8х10 кл/мл соответственно. Через 5 дней хранения дзета-потенциал клеток стал равен 15,5 MB. Зная, что дзета-потенциал полностью инактивированной культуры составляет 10,5 мВ, вычисляем коэффициент 0 =(15,5 — 10,5)x(25,4—

10,5) — 1=0,3. Из калибровки определяем, что

БК в результате пятидневного хранения культуры составляет 2,7х10 кл/мл. Традиционный способ — высев клеток на чашке

Петри — дал значение 2,4х10 кл/мл, Резуль9 таты определения БК, полученные двумя способами, дают совпадающие в пределах экспериментальных погрешностей величины, но в отличие от традиционного метода экспресс-анализ позволяет определять БК

5 клеток по электрофоретической подвижности в течение 10-20 мин, Пример 3, В табл, 2 приведены значения дзета-потенциала и БК культуры

Е.coll штамм М-17, подвергшейся разным

10 режимам инактивации.

Как видно из табл. 2, выживаемость клеток Е,соП, определенная двумя методами, дает близкие результаты, Из преимуществ метода можно указать

15 также точность определения изменения БК клеток, полученной по электрокинетическо му потенциалу.

Пример 4. На фиг. 2 представлен график зависимости БК от дзета-потенциа20 ла для клеток Е,coll M-17. На этой же фиг.2 приведены среднеквадратичные отклонения полученных экспериментальных результатов. Измерения проводились по мере инактивации культуры в результате хране25 ния при 4 и 20 С. Величина дзета-потенциала клеток определялась по измерению электрофоретической подвижности не менее 100 клеток, Точность определения величины дзета-потенциала клеток Е,coll

30 соответствовала Зо/ь. Численные значения

БК клеток определялись высевом клеток в

4-5 чашках Петри, Как показали измерения, точность определения изменения выживаемости, вычисленной по дзета-потенциалу, 35 превосходила точность определения изменения БК по традиционному методу в несколько раз.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н:- и я

Способ определения количества живых

40 клеток в биопрепаратах путем измерения физико-химического параметра исследуемой нативной и инактивированной культур с последующей оценкой результато™в,: о т л йч а ю шийся тем, что; с целью усКорения

45 и повышения точности способа, в качестве физико-химического параметра измеряют дзета-потенциал.

1735357

Таблица 1

Изменение физико-химических и биологических свойств клеток E,coll в процессе хранения культуры дри расчете параметра 0, величина (принималась равной 10,5 мВ, т.к. ниже этой величины дзета-потенциал клеток не опускался

Таблица 2

Изменение физико-химических и биологических свойств клеток Е.coli в зависимости от способа инактивации

* БК измерена традиционным методом;

** БК определена по дзета-потенциалу.

1735357

g о ду. р-1р

ЮГА l/

Составитель Ю. Медведев

Редактор М, Кузнецова Техред М.Моргентал Корректор С, Черни

Заказ 1792 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

z

e"

12 7714 /5 1б 17 Ю g gg 27 g ÿ

Фаг2