Способ получения коллагеновых микроносителей

 

Использование: биотехнология, культивирование клеток. Сущность изобретения: зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают щелочно-солевой обработке в течение 120-144 ч, образующуюся коллагенсодержащую массу пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80-140 мин , затем подают в осадитель через фильеры с диаметром 0,5-1,5 мм при ско р о сти вращения винта мешалки 1200-4000 мин . а далее осуществляют модификацию коллагена 0,85-0,90%-ным спиртовым раствором/ -5- (нитрофурил-2)-акролеина. 1 табл.

()9) (!!) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИ.К (5!)5 С 12 N 5/О

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4802935/13 (22) 15.03.90 (46) 07.06.92, Бюл, N 21 (71) Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности им. С, M. Кирова и Научно-производственный центр медицинской биотехнологии (72) Л. А. Вольф, 3. И. Пухова, Б. Б. Егоров, О. П. Буадэе, А, А. Царева, И. В. Киц, В. Ю. Мостовая, Н. В. Чурина, В. Г, Белорусский, M. Е:, Зуев,Л, А. Рудаков и Е.©;Beльчeва (53) 578.085.23(088.8) (56) Заявка ЕПВ N. 0101285. кл. С12 N 5!00, 1984.

Авторское свидетельство СССР

N 1396602, кл, С 12 N 5/00, 1986, Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения коллагеновых микроносителей, используемых в качестве субстрата для культивирования клеток.

:Известен способ получения коллагеновых микроносителей; заключающийся в том, что кожу теленка раэмалывают, размол помещают последовательно в 5ф,-ный раствор

NaCI, 1, -ный раствор бикарбоната натоия (для удаления растворимых компонентов) и воду. Далее в воду с размолом вводят пепсин в количестве 0,5 ф, от массы размола, затем добавляют соляную кислоту до рН 3.

Нерастворимый коллаген в этих условиях растворяется при.20-25 С и перемешивании. По окончании процесса растворения раствор коллагена фильтруют через фильтровальную бумагу, миллипоровские фильтры 1 мкм и 0,45 мкм. Фильтрат (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ (57) Использование: биотехнология, культивирование клеток. Сущность изобретения; зольный спилок шкур: крупного рогатого скота подвергают щелочно-солевой обработке в. течение 120-144 ч, образующуюся каллагенсодержащую массу пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80.-140 мин, затем подают в осадитель череэ фильерй с диаметром 0,5-1,5 мм при скЬрости вращения винта мешалки 1200-4000 мин, а далее осуществляют модификацию коллагена

0,85-0,90%-ным спиртовым раствором/3-5(нитрофурил-2)-акролеина. 1 табл. подщелачивают до pll 11 и оставляют на ночь. После этого рН снижают до 7,0-7,5 (при.этом коллаген преципитируется) и осадок промывают водой. Затем преципитат вновь растворяют в разведенной соляной кислоте при рН 3, вновь преципитируют подщелачиванием раствора до рН 7-7,5 и отделяют центрифугированием.

Химическое модифицирование полученного коллагена проводят путем обработки его янтарным ангидридом, При этом свободные аминогруппы коллагена превращаются в свободные карбоксильные группы и коллаген приобретает отрицательный заряд. Степень замещения аминогрупп на карбоксильные составляет 80-90 . Возможно дальнейшее модифицирование коллагена обработки его метиловым спиртом в присутствии кислого катализатора. При этом метиловые группы спирта взаимодей1738851 ствуют с карбоксильными группами коллагена, в результате чего отрицательные заряды, создаваемые карбоксильными группами, гасятся и коллаген приобретает положительный заряд. Степень метилирования составляет 60 — 80%.

Полученный описанными способами химически модифицированный коллаген растворяют в разбавленной .соляной кислоте (рН 3) и получают 0,3%-ный раствор колла- 10 гена. Эти растворы фильтруют через миллипоровский фильтр 0,45 мкм и разливают по

1 ч ультрафиолетом для сшивки коллагена

Затем коллаген-покрытие чашки трижды промывают раствором Хэнкса.

Культивирование клеток на полученных коллагеновых микроносителях осуществляют в присутствии эмбриональной коровьей сыворотки или фибронектина. Придание заряда поверхности коллагена улучшает при20 крепляемость клеток к субстрату и эффективность их роста. Кроме того, при 25 культивировании в этом случае клетки снимаются с поверхности с высокой степенью эффективности и без повреждения.

° Однако описанный способ получения коллагеновых микроносителей отличается 30 большой сложностью технологического процесса, которая состоит в необходимости многократной (4-кратной) фильтрации раствора коллагена через фильтры с малым диаметром пор.

Известен способ получения коллагеновых микроносителей для культивирования клеток путем щелочно-солевой обработки

35 эольного спилка шкур крупного рогатого скота в течение 96 — 100 ч с последующим

40 выделением коллагена в среду ацетона и модифицированием его 0,6-0,8%-ным спиртовым раствором Р-5-(нитрофурил-2) акролеина в течение 6-15 ч;

Однако культивирование клеток на пол-. 45 учен н ых этим способом микро носителях. позволяет достичь величины индекса пролифирации лишь на 4-е сутки 2,3 — 3,0.

Кроме того, получают коллаген в виде пленок, которые обладают недостаточным ра- 50 бочим обьемом, и для более удобного способа использования их необходимо измельчать до требуемых размеров, что является технологически трудновоспроизводи м ы м.

Целью изобретения является повыше55 ние качества коллагеновых микроносителей при сокращении длительности процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения коллагенновых микроносителей, заключающемуся в том, чашкам Петри. После высушивания асептически на воздухе чашки облучают в течение 15 что зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают щелочно-солевой обработке в течение 120-144 ч, обрзующуюся коллагенсодержащую массу пропускают через щелевой гомогенизатор при скорости вращения винта 80-140 об/мин, затем подают массу через фильеры с.диаметром отверстий 0,5-1,5 мм при скорости вращения мешалки 1200-400 об/мин на осаждение в среде ацетона, а модификацию выделенного коллагена ведут 0,85 — 0,90%-ным спиртовым раствором . P -5.-(нитрофурил-2) акролеина в течение 4 — 6 ч.

Полученные предлагаемым способом коллагеновые микроносители при использовании в процессе культивирования позволяют повысить индекс пролифирации с 2,3-3,0 (известный. способ) до 7-8,7.

Пример 1, Зольный спилок шкур крупного рогатого скота подвергают фосфатной обработке 0;6%-ным раствором дву-, эамещенного фосфата натрия при рН.8,9 в течение 12 ч. Затем в течение 120 ч подвергают щелочно-солевой обработке (150 r

NaOH на 1 л 1 н, раствора безводного сульфата натрия), а затем 1 н. раствором сульфата натрия. Ilocnt;:ýòorî . коллагенсодержащую массу промывают проточной водой для удаления ионов

$ 03 и нейтрализуют 0,02 н; раствором.соляной киелоты. Далее коллагеновую массу с содержанием 1,5% коллагена винтовым прессом при скорости вращения винта.80 об/мин под давлением 0,3 МПа подают через щелевой гомогенизатор на фильерный комплект осадителя, над которым на расстоянии 1 мм вращается лопастная мешалка со скоростью 1200 об/мин. Коллагеновая масса, проходя через отверстия диаметром 0,5 мм, осаждается в ацетон, разбиваясь на. мелкие частицы эа счет вращения мешалки.:

Обводненную массу с содержанием коллагена 30% подают на повторное осаждение свежей порцией. ацетона. затем на центрифугу, где содержание белка увеличивается до 75%. После центрифугирования проводят сушку коллагена и расфракционирование. Затем полученные частицы неопределенной формы модифицируют

0,85 %-ным спиртовым раствором Р--5-(нитрофурил-2) акролеина.

Режимы получения и свойства микроносителей по примерам 1-8 даны в таблице.

Таким образом, в сравнении с известным предлагаемый способ позволяет достичь. повышения качества коллагеновых микроносителей при сокращении длительности процесса.

1738851

Режим обработки

Качество елевото п та

Пример

Размер мик рочастиц, мкм

Увеличение численности клеток

S рн саэ-!

Концентрация раство ра неон, Скорость вращения винта. мин

Тенпеp3туpR, ОС. аН-Р4 Van

Диаметр фильеры, мм

Концентрация растко

p*

НФ4, KoHLIcHтрация раствора

1еат1РОК

СНО

Скорость вра щения мешалки. мнн

Продолжитель. ность" обработки. ч

0,85

15,0

120

0.6

8,9

1200

8.1 8,0

0.5

6.1

8,9

0.6

0,90

8к 85

0,5 1400

144

15,0

4.8

5.2

80

t2 *

144 15.0

8.9

1800

1.0

0,85

6.2

100

8.7 8,3

8,7 . 9 0

8.3 8.8

8,9

1,О 4000

15.0

0.6

6.6

144

0,95

5.1

5.8

15,0

8.9

5 0.6.120

2500

6.3

О 85

130

6 0.6

7. .О.Ь

15.0

8,9

6.2

0.90

0,5

5,2

6.8 63

8.9

1,5 1720

0.90

144

15,0

6.0

0.5

5,8

5.6

0.6

120 15.0

8.9

8.4 . 7.2. 0,90

П р» ма ч а н не. Конт ролр культивирования осуществляют нв микро»ос нтелях, полученных по известному способу и иа био микро»ос»теле

Цитодекс - 3.

Составитель 3; Пухова

Гзедактор B. Петраш Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А. Осауленко. Заказ 1978 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Лроиэводствен но-иэдател ьский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ получения коллагеновых микроносителей, включающий щелочно-солевую 5 обработку зольного спилка шкур крупного рогатого скота, осаждение образующейся коллагенсодержащей массы в среде ацетона с последующей модификацией коллаге-. на, отличающийся тем, что, с целью 10 повышения качества целевого продукта при сокращении длительности процесса, щелочно-солевую обработку проводят в течение 120 — 144 ч, образующуюся коллагенсодержащую массу перед осаждением в.среде ацетона пропускают через щелевой гомогениэатор при скорости вращения винта 80-.

140 мин, затем подают в осадитель через фильеры с диаметром 0,5-.1,5 мм при скорости вращения мешалки 1200-400 мин, а модификацию коллагена ведут 0,85-0,90 ным спиртовым раствором Р-5-(нитрофурил-2) акролеина,140» 40

180+ 60

180+ 20

150 »5б

ПО +40

150 О

180» 60

140+ 40

180» 40

140 +20

170 эЭО

150+ 40

180 80

150+ ЭО

160» 80

140+ 20