Штамм культивируемых клеток растений rноdiоlа rosea - продуцент фенольных соединений - адаптогенов
Использование: биотехнология, культивирование биомассы растительных тканей и клеток, медицинская, пищевая и косметическая отрасли промышленности. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea № 29, продуцирующий фенольные соединенияадаптогены. 3 ил.,1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (si> s С 12 N 5/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
4 3
Ql
Ql о (21) 4909148/13 (22) 21.12.90 (46) 07.04.92. Бюл. № 13 (75) И. В. Александрова и А. Н. Данилина (53) 57.086.83(088.8) (56) Муравьева Д. А. Фармакогиозия-M.:
Медицина, 1978, с. 543-544. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК
РАСТЕНИЙ RHODIOLA ROSEA — ПРОДУИзобретение относится к биотехнологии, а именно к получению на основе метода изолированных культур ценного растительного сырья, содержащего биологически активные вещества, необходимые для медицинской, пищевой и косметической промышленности.
Известно, что корневище растения
Rhodiola rosea L, семейства Crassulaceae используется в качестве лекарственного сырья.
Фармакологические исследования позволяют предположить, что большую роль в адаптогенном действии Золотого корня играют фенольные соединения, фенолоспирты и их гликозиды, содержащиеся в корневище родиолы розовой, Основной фенолоспирт здесь и-оксифенилэтанол, который содержится в сырье в основном в виде гликозида. Этот гликозид называют салидрозидом.
Содержание салидрозида варьируется в природном корне от 0,5 до 1% в зависимости от условий местообитания и фазы развития растения.
Родиола розовая растет в полярно-арктической и альпийской областях, основные промышленные заросли находятся на Алтае Ы 1725756 А3
ЦЕНТ ФЕНОЛЪНЫХ СОЕДИНЕНИЙАДАПТОГЕНОВ (57) Использование: биотехнология, культивирование биомассы растительных тканей и клеток, медицинская, пищевая и косметическая отрасли промышленности. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea ¹ 29, продуцирующий фенольные соединенияадаптогены. 3 ил.,1 табл, на высоте 1500-2500 м над уровнем моря, Популярность Золотого корня привела к истощению его запасов. Плантационное воспроизводство его мало рентабельно.
Цель изобретения — получение штамма культивируемых клеток растений Rhodiola
roseae L семейства Crassulaceae,oáëàäàþщего способностью продуцировать фенольные соединения-адаптогены.
В качестве исходного сырья для получения каллусной ткани служили 4-5 междоузлий стерильно растущих проростков в возрасте 45 дней. Отбирали наиболее активные, хорошо растущие каллусы.
Штамм ЗК-1 депонирован в коллекции культивируемых клеток высших растений
Института физиологии растений АН СССР.
Коллекционный номер штамма 29.
Каллусная ткань выращивается при 2224 С, влажности 65-70 (, в темноте на агаризованной питательной среде в течение
25-28 сут.
Состав питательной среды, мг/л:
НН4МОз 16400-16600
КМОз 18900-19100
Са Clr2 Н20 4300-4500 или
1725756
1,052-1,072
2,220-2,240
0,020-0,022
0,0024-0,0026
0,0024-0,0026
СаСЦ6НгО 6400-6600
Mg S04 7НгО 3600-3800 или
Mg S04 б/в . 1800-1840
ИаНгР042НгО 2520-2540
КНгР04 б/в 2020-2040
НзВОз 0,610-0,630
ZnS04Hz0 0,850-0,870 или
ZnS04 7Íã0
MnS04 4нго или
MnS04 5НгО 2,400-2,420
KI 0,082-0,084
NагMo04 2НгО 0,024-0,026 или
NazMo04 б/в
CuS04 5H20
CoClz 6H20 или
CoClz б/в 0,0013-0,0015 трилон Б 37,365-37,385
FeS0< 7НгО 27,75-27,95 а-НУК 2,0
Аденин 1,0
Кинетин 1,0
Тиамин-хлорид 0,3-0,5
Мезоинозит 75,0-85,0
Гидролизат казеина 500,0
Сахароза 30000,0
Агар 7500-8500
НгО До1л рН среды 5,8-6,2
Для выращивания применяют банки объемом 200 мл, содержащие 50-60 мл питательной среды. Кратность рассева 1:8-9.
Каллусная ткань от светло-серого и бежевого цвета (активно растущая) до коричневого и черного (старая); ростовой индекс 8-9 (по сырому весу), количество живых клеток 90-91 / при определении с помощью окрашивания 0,1/-ным раствором феносафранина.
Цитологическая характеристика.
Клетки неправильной угловатой формы, размеры 50-150 мкм, молодые клетки 25-50 мкм. В ткани встречаются отдельные сосудистые элементы, а также гидрозиды, B процессе роста клетки увеличиваются и отдельные достигают размера 370 мкм. Ядра в клетках, в основном, округлой формы, Они имеют от 1 до 8 ядрышек разного размера. Размеры ядер 10-60 мкм. Отдельные профазные ядра достйгают размера 90 мкм.
Динамика митотической активности представлена на фиг. 1.
Кариологическая характеристика.
Пределы варьирования по числу хромосом
100-600, модальный класс 116-170 (фиг. 2), Маркерные хромосомы отсутствуют.
Маркерные признаки: содержание фенольных соединений в пересчете на салидрозид 0,3, электрофоретический спектр растворимых белков — 15 полос {фиг, За), на
5 основании трех определений, электрофоретический спектр экстераз — 13 изоформ (фиг.
Зб, на основании трех определений), размах интенсивности по числу хромосом — 100-660 при модальном классе, содержащем 11610 170 хромосом (фиг. 2). Способность к морфогенезу отсутствует, Штамм культивируемых клеток Rhodiola
rosea ЗК-1 ¹ 29 является продуцентом фенольных соединений-адаптогенов. Способ15 ность штамма накапливать фенольные соединения определяет его активность. Для предлагаемого штамма в воздушно-сухой ткани на 25 сутки роста суммарное количество фенольных соединений в пересчете на
20 салидрозид составляет 0,25-0,357 на АСВ
{абсолютно сухие вещества), Фенольные соединения определяли спектрофотометрическим методом с использованием фиазореактива.
25 Для хранения штамма используют метод пересевов (продолжительность цикла выращивания 25-28 суток).
Пример. Каллусную ткань в количестве 1,5 г высевают в сосуд с 60 мл питатель30 ной среды следующего состава,мг/л;
МН4ИОз 16500
КМОз 19000
СаС г 2НгО 4400
Mg S04 7НгО 3700
35 NaHzP04 2Нг0 2530
КНгР04 б/в 2032
НзВОз 0,620
Zn S04 Í20 0,860
MnS04 4НгО 2,230
40 KI 0,083
NagMo04 2НгО 0,025
CuS04 5Íã0 0,0025
СоС!г 6НгО 0,0025 трилон Б 37,375
FeS04 7НгО 27,85 а-НУК 2,0
Аденин 1,0
Кинетин 1,0
Тиамин-хлорид 0,4
50 Мезоинозит 80,0
Гидролизат казеина 500,0
Сахароза 30000,0
Агар 8000,0
НгО До1л
55 рН среды 5,9
Выращивают 26 суток при температуре
22-24 С в темноте, Вес полученной биомассы составляет 22,8 г (380 г/л), сухой вес 0,78 г (13 г/л), Количество салидрозида составляет
0,33/ на АСВ.
1725756
Увеличение активности по сравнению с контролем, о
Коли- Показатель чество активности опытов в импульсах
М +Л
Условия опыта
Доза, мл/кг
Вводимый препарат
82,83«-16,4
259,7
0,001
С предварительной физической нагрузкой
10,0
Настойка из культуры тканей родиолы розовой
Физиологический раствор (контроль)
Настойка
Контроль
Настойка
Контроль
Настойка
Настойка
Настойка
Контроль
100
31.89 «-7,1
10,0
240,8
232
100
0,05
13
12
12
12
12
5,0
5,0
2,5
2,5
10,5
5,0
2,5
5,0
104 15+ 6 2
43,25«13,5
85,07 17,5
36,67«-18,6
101 16,4
104,2 «-18,6
100,6 «-17,5
92,0"-13,5
0,05
0,05
0,05
0,05
Без нагрузки
Для оценки адаптогенного действия препарата из культуры ткани родиолы розовой были проведены испытания на белых нелинейных мышах-самцах массой
18-22 г.
Настойку из культуры ткани родиолы розовой получали путем экстрагирования сухой биомассы культуры 40%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:10.
Перед введением препарата животным настойку упаривали на роторном испарителе при комнатной температуре до сухого остатка, а затем, добавляя к сухому остатку дистиллированную воду, доводили ее объем до исходного уровня. Сухой осадок экстракта полностью растворялся в воде, образовывая жидкость светло-желтого цвета.
Препарат из культуры ткани родиолы розовой вводили животным внутрибрюшинно. При этом диапазон исследуемых доз составил 0,05-0,2 мг на 20 г веса (2,5-10,0 мл/кг).
Действие адаптогенных препаратов способно проявляться лишь на фоне утомления (угнетения). Поэтому перед исследованием влияния препарата на активность животные помещались на третбан и получали предварительную физическую нагрузку в виде бега по "непрерывно бегущей дорожке" в течение 15 мин при скорости 23 м/мин, что составило 3/4 от максимально переносимой нагрузки (продолжительности бега животных). После снятия животного с третбана оно помещалось сразу в камеру "Аниме кса" (фирма Л КБ, Ш веция) специального счетного устройства, где активность оценивалась числом импульсов, являющихся ин5
30 тегральным выражением двигательной активности животного в камере за 5 мин.
Исследуемый препарат вводили подопытным животным за 40 мин до помещения на третбан. Контрольным животным за
40 мин до помещения на третбан внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объемах, аналогичных испытуемому препарату.
Аналогичные измерения были проведены с животными, не получившими предварительной нагрузки на третбане.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице.
Как видно из данных таблицы, настойка из культуры ткани родиолы розовой в дозах 2,5-10 мл/кг веса животного существенно увеличивает активность животных при предварительной физической нагрузке (132-160% по сравнению с контролем) и не оказывает стимулирующего действия на экспериментальных моделях без предварительного физического утомления (полученное различие статистически. незначимо).
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о выраженном адаптогенном действии настойки из биомассы радиолы розовой, Заявляемый штамм является первым для культивируемых клеток Rhodiola rosea семейства Crassulaceae перспективен для выращивания в промышленных условиях.
Формула изобретения
Штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea ВСКК-ВР ¹ 29-продуцент фенольных соединений-адаптогенов.
1725756
g4
Р2
12
29 с>
Л8
Числа хромосом
la3t а þ
А!ОС В О
Исо Ф сйсо WCOCh
O ОН С!!СЧ тВСО нсцс!! сис!! Смс!!См ! I ! I
СЧС Эс3 I&CO WCCIW
СООЪО OI СОЧ !О !
- - С!! СМ СМ Ol &l C!I соо ю с! !Оwсо нннн
I I
СОРОн
CQ cOW нннн
tDcD Сс! н Dl (Ч
Онн н н ! I
I lAtO C
0>Он ог
О>нн н н
РЭ: 1
Д! CO.
2Ф
Z,2 zoo
+ 1В ф1б
1ф 12
3 10
Ф
3 08
Pb
f0 12 14 1б 1Þ Ю 22 М 26 Щ Ю В РиЯ)
IC (Щ
1725756
Составитель И, Александрова
Редактор Н. Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова
Заказ 1188 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
