Способ регенерации растений подсолнечника

 

Изобретение относится к биотехполо гии, о частности к выращиванию растений in vitro, а более конкретно к способу регенерации растений подсолнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриоге неза. Целью изобретения является повыше ние выхода регенератов, а также повышение частоты образования зон эм( риои морфогенеза. Способ предусматри вает получение из незрелых зародышей соматических эмбриоидов и последующую регенерацию из них побегов на модифици рованных средах Мурасиге-Скуга и дат, нейшее корнеобразование H.I модифицированной среде Гамборга Вг, Способ позволяет получить массовую регенерацию растений подсолнечника. 3 з.п.Ф- лы, 1 табл. (Л С

СОК)З СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИС1И <ЕСКИХ

РЕСПУБДИК (р,0 ь

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4203619/13 (22) 29.10.87 (31) 8615299 (32) 30.10.86 (33) FR (46) 15.04.92. Бюл. ¹ 14 (71) Рон-Пуленк Агрошими (FR) (72) Жорж Фрейссине и Мартин Фрейссине (FR) (53) 57.086.83 (088.8) (56) Yreco В; et. al. Callus induction and shoot

regeneration in sunflower(Heliantus annus),—

Plant scienes letters, ч,36.

Paterson,Karol Е:Shoot multiplication In

Heliantus annus, — Am. j. Bot, ч. 70, ¹ 5 (pt2), 1983, р.881.

Espinasse А. ес.al.: Factors controlling 1п

vitro development of Sunflower embryos, agronomic, 1985, ч 5, ¹ 9, р 825 — 832.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выращиванию растений in

vitro, более конкретно оно.относится к способу регенерации растений подсолнечника иэ незрелых зародышей путем саматического эмбриогенеза, Известей ряд работ по регенерации растений подсолнечника . Так, известно получение регенерантов из сегментов солядолей и гипотиля, апексов побегов.

Недостатком данного способа является невысокий выход регенератив при высокой трудоемкости культивирования»

Известен также способ регенерации побегов подсолнечника из незрелых зародышей.

SU 1727514. А3 (Гн)с А 01 Н 4/00, С 12 l l 5/04 (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ

ПОДСОЛНЕЧНИКА (57) Изобретение относится к биотех><ологии, в частности к выращиванию растении in

VitrO, а бОЛЕЕ КОНКрЕтНО К СПОСОбу pere»<»i>ации растений подсолнечника из незрелых: зародышей путем соматического эмбриот» неза, Целью изобретения является noul t tlt» ние выхода регенерантов, а <л<»ж» повышение частоты образования зон эм1> рио- и морфогенеэа. Способ предусмлтрй вает получение из незрелых зародь<н»ей соматических эмбриоидов и последующу > регенерацию из них побегов на моди4>и<<и рованных средах Мурасиге-Скуга и даль нейшее корнеобразование нл модифицированной среде Гамборгл Б;, Способ позволяет получить массовук) г>ег»>нерацию растений подсолнечника. 3 э г>.ф лы. 1 табл, Однако данный способ Не обеспечив>л! t стабильного получения растений-г>ег» Il»! рантов.

Известен способ получения ргт<»1<Г". >тl I i тов подсолнечника из незр» л<,<х злрод .IIII(. <.1 путем их предварительной эксплл<<тл<111и 11 получения из них фертил<,111<х рлстений.

Однако данный способ) н» поэволяе t получить массовую реГе<<ег> ) 1 ill lo рлс1 внии ввиду низкого коэффици»н <л 1>лзм»<ож<)1<ия при использовании данного методл.

Цель изобретения - г<1)т<1. ш 111<е выхода регенерантов, а также по<"<<ление »лстоты образования эон эмбрио»:;!1 т»1»еэл.

1727514

Поставленная цель достигается путем использования трех последовательных этапов: первый этап образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей гормон; второй этап культивирования эмбриогенных каллусов для их роста, из развития и их прорастания в среде, содержащей гормон; в известных случаях, третий этап, состоящий в культивировании, позволяющем осуществлять рост и развитие растений; два первых этапа осуществляют в среде одной и той же природы и эта среда содержит гормон питокининового типа без гармона ауксина.

Растительные ткани, откуда можно извлекать эксплантаты для продуцирования соматических зародышей, происходят из культиваторов подсолнечника Helianthus

annuus, используемых главным образом в программах селекции. В качестве примера использовали 8 культиваторов (сортов), НА

89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, PT

26 и Giant Gray stripe Сорт НА 89 происходит от Dade Courits Флорида, сорта НА 290, НА

291, НА 300, НА 303, Т 76, и PT 26 происходят от Scedtec International i hc Калифорния, и Giant Gray stripede northruð Kind seeds

Калифорния, Эксплантаты происходят от растений, культивируемых в теплице и подвергнуты контролированному оплодотворению.

Предпочтительным эксплантатом для продуцирования каллуса является недоразвитый зародыш. Недоразвитые зародыши с околоплодниками выделяют из головок подсолнечника, когда они имеют возраст 4 — 21 день, их размер обычно составляет 0,.1 — 5 мм. Недоразвитые зародыши значительного размера могут быть разрезаны на несколько равных частей согласно плоскости, проходящей по оси перышка зародышевого корешка, что размножает число клонов, полученных иэ одного зародыша.

Способ согласно изобретению осуществляется следующим образом.

Сорта подсолнечника НА 89, НА290, НА

291. НА 300, НА 303, Т 76, PT 26 и Giant Gray

Stripe культивируют в теплице (26 С, 40 000 лк. фотопериод 15 ч в 1 день) и подвергают контролируемому оплодотворению. Недоразвитые зародыши извлекают спустя 4 — 21 день после опыления. Отделенные от головок зерно стерилизуют путем погружения на 20 мин в раствор жавелевой воды с 3 CI, в который добавлено. несколько капель смачивателя, затем промывают 3 раза стерильной ристиллированной водой. Зародыши затеи изолируют в асептических условиях, в известных случаях разрезают и помещают в первую среду - среду индукции зародышей.

Эта первая среда включает минераль- ные соли, витамины, аминокислоты, сахароэу и гормон в количестве, достаточном для

55 образования каллуса, Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов, Макроэлементы, используемые в этой первой среде, могут быть выбраны, например, среди следующих соединений: сульфат магния, хлорид кальция, монофосфат калия, нитрат калия и нитрат аммония. Из солей на основе олигоэлементов можно назвать: борная кислота, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдан натрия, сульфат меди (Il),хлорид кобальта; иодид калия и хелат железа-Na-ЭЛТК, Эта комбинация минеральных солей известна под названием Murashige u Skoog (MS), Предпочтительные количества макроэлементов и олигоэлементов нэ.1 л среды следующие, мг: 370 гептагидратированный сульфат магния, 440 дигидратированный хлорид кальция, 170 дигидрэтивный моносульфат калия, 1900 нитрат калия, 1650 нитрат аммония. 6,2 барная кислота, 22,3 тетрагидратированный сульфат марганца, 8,6 гептагидратированный сульфат цинка, 0,25 дигидратированный молибдэт натрия, 0,025 пентагидратированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,83 иодид калия, 36,7 хелат железоNa-ЭТЛК, Первая среда содержит также витамины, такие как никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, мио-инозитол. и аминокислоту, такую как аланин, глутамин, серин, триптофан, цистеин и предпочтительно глицин.

Предпочтительными количествами витаминов и аминокислот на 1 л среды являются, мг: 0,5 никотиновэя кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 100 мио-инозитола, 2 глицина.

Первая среда также может содержать добавку витамина и аминокислот. Эта добавка не является необходимой для образования соматических зародышей, но она увеличивает их частоту. 8 этом случае предпочтительными количествами витаминов и аминокслот на 1 л среды являются, мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиаминэ, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 4000 миониозитол, 1000 1-аланин. 800 1-глутамин, 160 1-серин, 50 триптофан, 10 1-цистеин; 2 глицин.

Сахароза, содержащаяся в первой среде, имеется в количестве 8 — 12, и редпочтительно 9%.

Гормон первой среды, выбор которого является характеристикой изобретения—

1727511.

15

35

50

55 пито:<ининового типа, например кинетин или б-бензиламинопурин, и предпочтительно последний. Обычно пригодны количества

0,5-1 мг на 1 л среды. Агар, Phytagar или

Gelrlte используется для создания твердой 5 среды. Конечная концентрация 0,6% для

Phytagar или 0,3 для Gelrite дает хорошие результаты. рН-значение среды может меняться от 5,0 до 6,3 в предпочтительно составляет 5,0.

Среду стерилизуют в автоклаве за исключением гормонов, которые стерилизуют путем фильтрации через микропористую мембрану.

Недоразвитые зародыши, выделенные как описано выше, помещают в эту первую среду, культивируют в течение около 2 — 3 недель в темноте при 26 С. В течение этого периода зиготические зародыши развиваются и соматические зародыши появляются 20 на уровне гипокотиля и на внутренней поверхности семядолей в случае культивара (сорта) llA 291. Затем соматические зародыши могут быть изолированы и помещены во вторую среду — среду роста проростков. Эм- 25 бриогенный каллус или выделенные зародыши культивируют во второй среде в течение 2- 8 недель при 26 С и на свету (1500 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. В течение этого периода зародыши прорастают и образовавшиеся ростки развивают в известных случаях. корни.

Вторая среда, как и первая, содержит минеральные соли, витамины. аминокислоту, сахарозу и гормон, Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов, Макроэлементы, олигоэлементы, витамины и аминокислота те же, что и в первой среде, и идентичных концентра- 40 циях без добавлений. Сахароза имеется в количестве предпочтительно ниже такого первой среды, например 2-4, предпочтительно 3, Используемым гормоном является цитонинин, предпочтительно идентичный или отличный от первой среды, предпочтительно 6-бензиламинопурин. Обычно пригодны количества 0,1 — 0,5 мг на лист. Агар Phytagar или Gelrite используется для создания твердой среды. Конечная концентрация 0,6 для Phytagar и 0,3% для Gelrite дает хорошие результаты. Среду стерилизуют.как и ранее, рН среды 5,0 — 6,8, предпочтительно рН 5,0.

Спустя 2-5 недели пребывания во второй среде, выделенные соматические зародыши прорастают и превращаются в ростки

2-5 см. Ростки, которые развили корни, могут быть высажены в землю, стерильную смесь торфа, нермикулитэ, тонкодисперсного песка (3:2:i), содержащуюся в горн клх

Jibbi. Горшки помещаю1 в бак,.заполненный влажным песком, и покрывают про.трач ным полиэтиленовым пакетом для поддержания высокой степени влажности.

Всю совокупность помещают в климатическую камеру с температурой 15 С (6000 лк) с фотопериодом 12 — 16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день. Спустя 10 дней растения помещают в более крупные горшки и культивируют в теплице при 26 С (40000 лк) с фотопериодом 12 — 16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день.Растения, которые не развили корней, могут быть привиты к молодым растениям, культивируемым в теплице, согласно классическому методу либо помещены на период 10 — 20 дней в среду для укоренения или в третью среду.

Третья среда включает минеральные соли, витамины и сахарозу. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов. Используемые в этой третьей среде макроэлементы могут быть выбрань1 среди следующих соединений сульфат ма ния, хлорид кальция, мононатрийфосфлт, нитрат калия и сульфат аммония. Среди с<>лей на основе олигоэлементов можно назвать борную кислоту, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдат натрия, сульфа меди (ll), хлорид кобальта, иодид калия и хелат Fe-Na-3TJlK. Эта комбинация минеральных.солей известная под названием Б

5, Предпочтительные количества макроэле ментов и олигоэлементов на 1 литр среды следующие мг,; 250 гептагидратированный сульфат магния, 150 дигидратированный хлорид кальция, 169 моногидратированный мононатрийфосфат, 3000 нитрат калия, 3 борная кислота, 13,2 тетрагидратированный сульфат марганца, 2 гептагидратированный сульфат цинка,. 0,25 дигидратированный молибдат натрия, 0,025 пентагидратированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,75 иодид калия, 40 хелата Ре-Ма

ЭДТК.

Третья среда также содержит витамины.

Это никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, и мио-инозитол. Предпочтите ьными ко личествами витаминов на 1 л среды являются, мг: 1 никотиновой кислоты, 10 хлоргидрата тиамина, 1 хлоргидрата пиридоксина и 100 мио-инозитола.

Третья среда содержит также сахарозу и активированный уголь и/или гормон ауксинового типа. Сахароза имеется, например, в количестве 1-2 . предпочтительно

1, а активированный уголь в количестве

17275Л4

0.1 . Если испольэовать гормон вместо активированного угля, то выбирают 3-индолуксусную кислоту в дозах 0,1-0.2 мг на 1 л.

Агар Phytagar или Gelrlte. используют для создания твердой среды . Конечная концентрация 0,5ф для Phytagar и 0,25$ для

Gelrite достаточная. рН среды может изменяться от 5.0 до 6,0 и предпочтительно составлять 5,0. Среду стерилизуют в . автоклаве.

Растения культивируют в этой среде в течение:2-3 недель при 26 С на свету (1500 лк) с фотопериодом 12-16 в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день. Растения образуют корни и могут быть высажены в землю.

Полученные этим способом растения могут быть фенотипически отличными от исходного материала вследствие стресса ин витро. Растения опыляют вручную и выдерживаются вплоть до сбора семян, Несколько единиц зерен сажают для анализа новых растений подсолнечника и селекции возможных интересных мутантов, которых затем вовлекают в программу селекции разновидностей;

Пример 1, Приготовление маточных растворов а. Маточный раствор В5. Маточный раствор В5, концентрированный десятикратно, готовят растворением пакетика со средой

В5 без сахароэы Flow Laboratories (содержит минеральные соли 85; 1 мг никотиновой кислоты, 1 мг пиридиксина — Н01, 10 мл триамина. НО и 100 мг иноэитола,. в конечных концентрациях) в 100 мл (конечный объем) дистиллированной в деионизированной воды. Маточный раствор разделяют на аликвоты по 100 мл и хранят при -20 С. б. Маточный раствор BAP. Раствор BAP с 1 г/л готовят путем растворения 100, мг

6-бензиламинопурина в нескольких мл 0,15 и НС1, слегка нагревая. и разбавления 160 мл дИстиллированной и деионизированной воды. Этот. раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnisart ММ 0,2 микрона (Saitorlus) перед его добавлением k

nepaoA è второй средам. в. Маточный раствор AIA. Раствор А1А с 0,2 г/л готовят растворением 20 мг 3-индол-уксусной кислоты в нескольких миллиметрах чистого этанола и разбавлением 100 мл дистиллированной и деионизированной воды. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnlsart ИМ1 0,2 мкм (Sartorlus) перед добавлением к третьей среде.

° г. Добавка витамина: и аминокислот согласйо Chaodler u BEARD.

Исходный раствор витамина и аминокислот, двадцатикратно концентрирован5 тиллированной- и деионизированной воды, Исходный раствор разделяют на аликвот10

: нокислот, рН доводят до 5,0 с помощью 0,1

20 H. раствора гидроксида натрия, объем дово25

30 первой среде образом. растворяя совокупность пакетика со средой М, 30 г сахарозы

55 нйй, готовят растворением совокупн Jctvl 30 г мио-инозетола 10 r (=аланина, 8 r 1=глутамина, 1,6 г 1=серина, 0,5 (=триптофана и 0,1 г L-цистеина в 500 мл (конечный объем) дисные части по 50 мл и хранят при -20 С .

П р и м: е р 2. Приготовление сред. а. Первая среда или среда индукции зародышей. Среду готовят растворением пектина со средой IVturashlge u Skoog без сахароэы Flow Laboratories, содержит минеральные соли МЗ 0,1 мг тиамина, HCI 0,5 мг пикотиновой кислоты, 0,5 мг пиридоксина.

HCI, 2 мг глицина и 100 мг инозитола и

90-120 г сахарозы в дистиллированной и деионизировенной воде. После возможного добавления 50 мл добавки витамина и амидят до 1 л и после добавления 6. г Phytagar (Cibco) или 3 г Gelrite (Kelco) смесь выдерживают в автоклаве в течении 20 мин при 120

psi. Когда смесь остыла, в нее добавляют

0,5 — 1 мл раствора BAP (2,2-4,4 мкмоль), стерилизованного, как описано выше; Смесь затем выливают в чашки Гретри, . б. Вторая среда или среда роста проростков. Вторую среду готовят идентичным и 6 г Phytagar или 3 г Gelrite в 1 л воды, добавляют после выдерживания в автоклаве 0,1-0,5 мл стерильного раствора ВАР (0,44-2,2 мкмоль). Среду выливают в чашки

planteon (Flow Laboratories) в, Третья среда или среда укоренения.

Третью: среду готовят добавлением 1020 r сахарозы на 100 мл исходного раствора

В5, в дистиллированной и деионизированной воде. рН доводят:до 5 0 с помощью 0,1н, раствора гидроксида натрия, затем объем доводят до 1 л и добавляют смесь 0,5 r

Phytagar и 1 r алкированного,угля. После прохождения автоклава, среду выливают в

Mason jars. Если хотят использовать третью среду, содержащую А1А, то активированный уголь не употребляют во время приготовления этой третьей среды. После прохождения автоклава в остывшую среду добавляют 0,5-1 мл стерильного раствора

А1А (0,57-1,14 мкмоль), Среду выливают идентичным образом в Mason jars.

Жидкий вариант третьей среды включает.только минеральные соли е 5 и 1 Д сахароэы, при рН 5.0. Смесь распределяют на фракции по 10 мл в стеклянные трубки, содержащие мостики иэ филь1ровальной бумаги, согласно способу. описанному

172 /514

CHAi101 ЕВ и BEARD. затем выдерживают.в автоклаве, Пример 3. Недоразвитые зародыши с их околоплодниками отделяют от головки подсолнечнике (Helianthus annuus, разновидность T76B), когда они достигают размера 0,5-1,5 мм. Зерна стерилизуют в течении

20 мин в растворе кавелевой воды в с 3" Cl и споласкивают дистиллированной водой, Недоразвитые зародыши отделяют от их оболочек и помещают в чашки Петри на первую среду. Первая среда получена описанным образом, с 90 г/л сахарозы и 0,5 мг/л

BAP (2,2 — мкмоль), Чашки Петри инкубируюг в темноте в течение 3 недель для того, чтобы привести к образованию соматических зародышей.

В этой стадии, соматические зародыши, которые начали прорастать, отделяют от зиготического зародыша и помещают на вторую среду в чашки Planteon. Вторая среда, приготовленная как описано выше, содержит 0,1 мг ВАР на 1 л или 0,44 мкмоль.

Зародыши культивируют на свету в течение

3 недель и они дифференцируются по росткам.

Ростки высотой 2 — 5 см затем переносят на третью средудля инициирования образованием корней. Третья среда, приготовленная как описано выше, содержит предпочтительно 10 г сахарозы. В случае эастудневания среды добавка 1 г/л активированного угля удаляет остаточное влияние

ВАР, осуществляемое в предыдущей среде

MAENE .И DEBERGH, Plant СЕИ Tissue

Organ Culture и благоприятствует быстрому росту корней. Спустя примерно 2 недели ростки могут быть высажены в землю, Если ростки начали развивать корни на второй среде, то они могут быть введены в контакт с третьей жидкой средой, согласно технике, описанной CHNDLER u BEARD.

Это устройство позволяет значительно развивать корневую систему и избегать повреждения корней во время высадки в землю.

Пример 4. Недоразвитые зародыши

He)ianthus annuus разновидность НА 89 отбирают, когда они достигают роста 0,1-0,5 мм, с эндоспермом на первую среду. Первая среда содержит 90г сахарозы и 0,5 мг ВАР на 1 литр или 2,2 мкмоль. Спустя 3 недели в темноте соматические зародыши изолируют и помещают на первую свежую среду все время в темноте. Вторичные соматические, зародыши образовываются на изолированных зародышах. Спустя 3 «чедели пребывания в темноте вторичные соматические зародыши изолируют и помещают на вторую среду. Вторая среда содержит >0 « - харозы и 0,1 мг на 1 л (0,44 мкмол«,).

Ростки, которые развиваются, з>3««.««могут быть перенесены на третью сргду 3 ««д

5 кую или, подвергнутую застудновл««и«о д3в укоренения. затем будут пересажены в з .млю, Пример 5. Недоразвитые зародь«ши

He!ianthus annuus, разновидность НА 89 от10 бирают спустя 21 день после опыления, о««и имекц. размер 5 мм, Их отделяют от их оболочек и до внесения на первую среду разрезают на четыре равные части продолh«««3 согласно двум перпендикулярным плоско

15 стям между ними и параллельным оси и ..рышка первичного корешки. В этом слу «ао первая среда содержит 90 г сахарозы и 1мг

BAP на 1 л. Спустя 3 недели в темноте сом»тические зародыши изолируют и поме«цзю«

20 на вторую среду.,Вторая среда соде««жит 30

r сахароэы и 0,5 мг BAP на 1 л, Ростки, которые развиваются, затем могут быть перенесены на третью среду (жидкую или подвергнутую застуднева«««««о) двя

25 укоренения, затем Bblca>Ke«lb« в земл«о. Ростки, которые не имеют корней, могут быг« привиты к молодому растению согласно М«, тоду,описанному HABEIMANN и й/ai l асv..

Пример ы 6-27. Приведенные прим«.

30 ры дают комбинации, которые мож««о <«су ществлять, используя различные о««««с;3«3«3«.«; примеры.

Предлагаемыйспособпозволяет пол «ит« массовую регенерацию растений под35 солнечника из незрелых зародышей. путом соматического эмбриогенеза.

В таблице представлены результаты ис следований действия способа на разли ««««>«х линиях подсолнечника.

40 Формула изобретения

1. Способ регенерации растений подсолнечника, включающий три последо««ательных этапа, при этом первый эт iri

45 предусматривает получение из эксплантов эмбриогенных каллусов и соматических эм бриоидов с последующим их ростом ««а модифицированной питательной среде

Мурасиге — Скуга, второй этап — форм««ровв50 ние проростков и развитие их в рас«а««ия Ii 3 модифицированной питательной среде Мурэсиге — Скуга и третий этап -- формирогание и рост корней у полученных растений на питательной среде, содержащей источники

55 азота, фосфора, калия, углерода, микроэлементы, витамины и стимуляторы роста, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода регенерантов, в качестве эксплантов используют незрелые зародыши в возрасте от 4 до 21 дня размером 0,1-5 мм.

11 1727514 12

Сахаро- Среда 1

Приме Разно- Размер, Разрезы видность мм

Среда It

Основная среда за; ь

Сахаро- ВДР, Укоренеза, 2 мг/л ние

NS

38 сахароза + 0,5 ВАР

М$

6 Т76

1,5

МЯ

11$

МБ

7 Т76

8 Т76

1,5

III SC

111 L

III SC

111 SC

1,5

3

3 О,!

9 Т76 !

О Т76

1,5

НЯ

ИБ

1,5

0,5

И$

1! Т76

l 2 Т76!

0,5

0,5! 5

MS вв

И$

НБ

3 0,1

0il 1II

l,5

111 SA

О,!

М$9

13 Т76 к Т76

15 Т76

16 Т76

0,5 HS

Э 0,5

111 SC

Ш !.

111 $(.

И$

6 3

0,5

МБ

Э 0,5

3 0.5

«5

0,5 MS

MS. «5

ИЯ

0,5

0,5!

7 RT 26 !

8 RT 26

6 1,5

СЭ!

ИБ

НЯ

0,5 MS

О,l

11t l.

Ill SC

111 SC

ПI SC

111 1.

111 SC

III SC

111 L

I11 БС

0,5

О,!

МЯ

0,5!

9 НА 89 6!5

20 НА 89 6 3

2l НА89 63

22 НА 89 ь 3

0,5

МЯ

0,5

HS

0,5

И$

0,5

0,5

М$

0,5

НЯ

О,!

«5

23 НА 89

2«НА 89

0,5

HS

0,5

«5

0,5 !

0,5

Н$

25 НА 89 > 5

26 НА 29! 6 1,5

27 НА 29! «5

NS

0,5

0,5

О,!

III SA

0i!

t1I SA

0,2

IП SC

ИБ

0,5 НБ

О,!

0riee с Э

Ятау

err!pe

ms sup 9

0,5

Qi l

" Нодиаицилоеамная среда ИЯ содеркит 600 мг дигидратированного хлорида кальция, !260 иг нитрата калия, 1!00 мг нитрата аммония и 250 мг иио-ниозитола на л среды, другие е я, злементы остаются неизнениыми.

Нололнтиизв среда И; IIISA - твердая среда 1AlA.(0,! или 0,2 мг/и)! 111$С - тверлал среда 111 актиаировенныд уголь; NL - мидкая среда 111.

Составитель сЭ.Демкин

Техред M.Moðãåíòàë

Редактор M.Håäoëó>êåíêî Корректор Л.Патай

Заказ 1283 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКИ 1 С(P

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

П1тоиз!эолсгвенно иэдлтельсмь!11 комбинат "Патент". г Ужгород, ул i al;l!»!н 1п1 первый этап осуществля1от на питательной среде в присутствии 2,2--4,4 моль/л 6-бензиламинопурина, 0,5 мг/л.никотиновой кислоты, 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоинозитола, 2 мг/л глицина,при содержании сахарозы 9-12%, второй этап осуществляют в присутствии 0,44 — 4,4 ммоль/л 6-бензиламинопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0.1 мг/л хлоргидрата тиамина, О!5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миокнозитола, 2 мг/л глицина, при содержании сахарозы 3%, третий этап осуществляют на

1 мг/л модифицированной никотиновой кислоты, 10 мг/л хлоргидрата тиамина, 1 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоинозитола, 0,1-0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, при содержании сахарозы 1-2%, при этом после второго этапа полученные растения привива!от,2 Способ по п.1, 7 т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения частоты образования зон эмбрио-4 морфо- генеза, на первом этапе в питательную сре5 ду дополнительно вносят 3900 мг/л миоинозитола. 1000 мг/л L-аланида, 160 мг/л 1=серина, 800 мг/л L-глутамина, 50 мг/л 1=триптофана, 10 мг/л L-цистеина, 3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и-10 и с я тем, что используют линии подсолнечника Т 76, PT 26, НА 89, НА 291, Giant Gray.

Strine.

4. Способ по пп. 1-3, о тл и ч а ю щи йс я тем, что после второго этапа растения, 15 имеющие корни, высаживают в землю и инкубируют в климатической камере при 15 С, интенсивности освещения 6000 лк с 15-часовым фотопериодом.