Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании пыльников гибридных растений для получения нового исходного материала. Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур. Способ предусматривает выращивание пыльников на искусственной питательной среде с получением растений-регенерантов, при этом перед помещением пыльника на среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса, что соответствует наиболее благоприятной для андрогенеза стадии развития микроспор. 5 табл. СО С vi N3 0 оо оо
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК. Ж» 1724688 А1 (й)5 С 12 N 5/04, А 01 Н 4/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ДВТОРСКОМ / СВИДКТКЛЬСТВУ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании пыльников гибридных .растений для получения нового исходного материала, Целью изобретения является увеличение выхода змбриоидных структур. Способ предусматривает .выращивание пыльников на искусственной питательной среде с получением растений-регенерантов, при этом перед помещением пыльника на среду цитологически выявляют наличие фиброэных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса, что соответствует наиболее благоприятной для андрогенеза стадии развития микроспор. 5 табл, (21) 4854022/13 (22) 24.07.90 (46) 07.04.92. Бюл. М 13 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) В.Ю.Горбунова (53) 578.085.23 (088.8) (56) Лукьянюк С,Ф., Игнатова С.А. Факторы. определяющие морфогенез и выход гаплои-. дов в культуре пыльников тритикале It. Teop. и прикл. аспекты селекции и семеноводства пшеницы, ржи, ячменя и тритикале, Тез. докл. Межд. конф. уч. стран СЭВ-Одесса:
ВСГИ, 1981, с. 34 — 35.
Не Ding-gang, Quyang jun-Wen, Callus
and plantlet formation from cultured wheat
anthers at different developmental stages.—
Plant ScIence Leners., 1984, 33, р. 71-79.
Романов И.Д. Развитие пыльцы пшеницы по наблюдениям на живом материале.—
Il бюл., ВИР, 1970, вып. 5, с, 38-46.
Dali P.: Pollen dimorphism and anther
culture barley,— Plants, 1975, v, 127, М 3, р.
213-220.
Батыгина Г.Б. Хлебное зерно, Атлас.—
Л.: Наука, 1987, с, 103.
Паушева З,П. Практикум по цитологии растений.— М.: Агропромиэдат, 1982, с. 272.
Quyang Т,W., Н.Ни, С.С. Chuang and С.С.
Tseng //Inductrion of pollen plants from
anthers of Triticum aestivum L. cultured Ь
vitro.— //Sci. Sin, 1973, 16, р. 79 — 95. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ ЗЛАКОВЫХ
РАСТЕНИЙ
)Я (Ф (01
Изобретение относится к биологии и генетике и биотехнологии при культивироможет быть использовано в эмбриологии вании пыльников гибридных растений с при уточнении стадий микроспорогенеза, в целью получения гибридных линий продви1724688 10 25 40 50 нутых поколений и селекции — для создания многообоазного исходного материала и константных гибридных линий. Известен способ культивирования пыльников злаков, при котором котором пыльники имплантируются на искусственную питательную среду на стадии, когда микроспора проходит%z фазу клеточного цикла. Недостатком этого способа является невозможность точного определения названной стадии развития микроспор. Известны работы, в которых указывается, что оптимальной стадией является стадия средней или поздней вакуолизированной микроспоры. 1 Однако и в этой, работе не указывается, как ее определить, поскольку показано, что наличие вакуоли является не самым главным признаком при определении стадии развития микроспоры. Основным критерием при определении стадий одноядерного пыльцевого зерна является расположение ядра по отношению к поре. Наличие большой вакуоли, оттесняющей ядро к стенке, противоположной поре прорастания, позволяет отнести такую микроспору к поздней одноядерной стадии, Вакуоль появляется уже в средней одноядерной стадии развития микроспоры. Ядро при этом занимает различное положение по отношению к поре, В то же время известно, что в один и тот же момент наблюдения в одном и том же пыльнике будут наличествовать микроспоры на разных стадиях развития, 3 Недостатком известных способов является расплывчатость и неконкретность в определении стадии имплантации микроспор, На основании цитологического изучения большого количества микроспор в пыльниках некоторых видов злаковых, таких, как яровая мягкая пшеница, озимая рожь и тритикале, в течение ряда лет дает основание уточнить имеющуюся классификацию стадий микроспорогенеза и дополнить ее новыми характеристиками, касающимися как состояния микроспор, так и стенок пыльника. Подвергается существенной коррекции поздняя одноядерная стадия развития микроспоры пыльника, на которой ядро микроспоры оттесняется центральной вакуолью на противоположную поре микроспоры сторону. Она продолжительна во времени и за это время происходят существенные изменения в стенке пыльника. Синхронизация 5 стадий микроспорогенеза и состояния стенок пыльника проведена впервые. Иэ анатомии растений известно, что стенка пыльника состоит иэ экзотеция, эндотеция и тапетума. На поздних стадиях развития пыльника в эндотеции появляются фиброэные утолщения. Однако в этих ссылках нет указаний на состояние микроспор или пыльцевых зерен, соответствующих данной стадии, Мелкие фиброзные бляшки впервые появляются, когда популяция микроспор в пыльнике имеет следующий состав: 50% микроспор на средней стадии микроспорогенеза; 50% микроспор на поздней стадии, Синхронно с увеличением популяции поздних микроспор утолщается и фиброэный слой эндотеция. Изолирование пыльников на этой стадии и культивирование их на питательной среде !и vitro позволяет получать наивысший выход эмбриоидных структур. Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур. Способ состоит в том, что проводят onределение стадии развития микроспор, культивирование их на питательных средах, получение эмбриоидов и регенерацию из них растений, при этом основной упор делается на точное определение стадии развития микроспор, способных к прямому эмбриоидогенеэу. Способ осуществляют следующим образом. У пыльников средней части колоса определяют стадию развития микроспор. Для этого готовят сдавленный ацетокарминовый препарат. Проводят подсчет числа микроспор с различной стадией развития. Для определения стадии развития микроспор извлекают пыльник из колоска средней части колоса. Располагают его в каплю 1%-ного ацетокармина на предметном стекле. Каплю разогревают на пламени спиртовки, не допуская закипания. Затем препарат кантируют покровным стеклом и раздавливают. Исследуют препарат в микроскопе в проходящем свете. Отмечают стадии развития микроспор, подсчитывают количество микроспор. На этом же препарате исследуют стенки пыльника. Фиброзные утолщения имеются, если большинство микроспор (70-90%) находятся на поздней одноядерной стадии— единственное ядро микроспоры оттеснено вакуолью к стенке микроспоры, отстоящей напротив поры. Отбирают колосья, содержащие такие микроспоры (т.е. хорошо развитые фиброзные утолщения в стенке пыльника), стерилизуютдиацидом, изолируют пыльники, культивируют их на питательной среде Potatoll (табл. 5), в которой представлен состав питательной среды для 1724688 Та блица! фиброзные утолщения Количество.Год культи ви рования Сорт Г Поздних микроспор, I Образо" вавшихся эмбриоидов, Ф Культивированных пыльников,шт 74 282 71 28 115 12 58 317 62 21 . 218 2 5 64 412 31 18 115 1,5 Скала 1987 Есть Нет Есть Нет Есть Нет 1988 1989 инициации эмбриоидов в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы. Поверхностно стерилизованные пыльники, извлеченные из двух нижних цветков 6 — 8 колосков средней части одного колоса, 5 помещают в одну биологическую пробирку с питательной средой, Штативы с пробирками ставят в темноту на 7 дней в термостаты с температурой+32 С. Затем культивирование продолжают в темноте при 27 С до об- 10 разования эмбриоидов. Пример 1. Колосья сорта яровой мягкой пшеницы Скала срезают в поле или в теплице. Цитологически выявляют наличие фиброэных утолщений в эндотеции с 15 одновременным подсчетом числа поздних микроспор. При нахождении соответствующей стадии колосья стерилизуют, изолируIQT пыльники и имплантируют их На питательную среду. Через 28-30 дней куль- 20 тивирования появляются первые эмбриоды (табл. 1). Пример 2. Аналогично примеру 1 производят культивирование изолированных пыльников сорта Соналика (табл, 2), 25 Пример 3; Аналогично примеру 1 определяют стадию развития микроспор и фиброзных утолщений у Линии 35, Данные приведены в табл, 3. Пример 4. Аналогично примеру 1 исследуют культуры изолированных пыльников озимой ржи сорта Чулпан и тритикале (табл. 4). Преимуществами изобретения являются высокий выход эмбриоидов, быстрота определения стадии развития, большая экономия времени, средств и реактивов, возможность круглогодичного эксперимента, многократное увеличение выхода эмбриоидов и растений в культуре in vitro no сравнению с известным способом. Формула изобретения Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений путем помещения пыльников на искусственную питательную среду и выращивания до образования эмбриоидов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода эмбриоидных структур, перед помещением пыльников на питательную среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса. 1724688 Табли ца 2 Количество Фиброзные утолщения l поздних микроспор, 4 Сорт Год культивирования образовавшихся эмбриоидов, 4 культиви, рованных пыльников шт. 1988 1989 Т а б л и ц а 3 Год культивирования Фиброзные утолщения Количество Сорт образовавшихся эмбриоидов 4 поздних микроспор,Ф культиви» рованных пыльников, о Есть Нет Есть Нет Линия 35 1988 64 17 72 318 119 318 214 71 1,7 58 4,3 1989 Та бли ца 4 Сорт Год культи" вирования Количество образовавшихся эм бриоидов,3 культивированных пыльников, щт. поздних микро" спор, 4 1988 58 24 64 314 117 412 115 Есть Нет Есть Нет 1988 Сона" 1986 лика 1987 Чулпан (o3имая рожь) Тритикале Есть Нет Есть Нет Есть Нет Есть. Нет 27 64 32 73 28 72 Фиброзные утолщения . 396 213 214 118 158 172 417 178 48 1,5 32 2,8 2,4 24 1,5 62 2,5 1724688 Та бли ца 5 Состав питательной среды Potato II Компоненты Содержание компонентов в среде Potato II, мг/л Картофельный экстракт 10ф 1 000 rN0> Са(ИО ) 4Н О МК$0 7Н О (НН4) $0 кН РО4 КС1 100 125 100 200 ИН НО РеSO 7Н О Na Ng$04. Н20 7п$0 . 7Н, О 27,8 37,3 Н ВО 1,0 Тиамин-НС1 Глицин.Пиридоксин-НС1 !!ийЬтиновая кислота Аспарагиновая кислота Сахароза 2,4-Д 70000 0,1-1,5 Индолилуксусная кислота Кинетин Иезо-инозит 5,8 рН Составитель В. Горбунова Техред М. Моргентал Корректор М. Кучвряввя Редактор И. Дербак Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1150 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5
