Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к антигену рsеudомоnаs рsеudомаllеi, не реагирующих с близкородственным возбудителем сапа

 

Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения: штамм получают путем слияния с помощью полиэтиленгликоля клеток мышиной миеломы РЗ-Х63-А.8.653 с лимфоцитами мышей Balb/c. Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии АН СССР под номером ВСКК (II) 388Д. Штамм продуцирует моноклональные антитела (МКА) тип a IgM, титр МКА в культуральной жидкости - 1:40 - 1:160, в асцитической жидкости - 1:104 - 1:105. МКА взаимодействуют с типичными штаммами Pseudomonas pseudomalleei и не взаимодействуют с типичными штаммами Pseudomonas mallei. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 28 пассажей без потери активности. МКА используют для идентификации возбудителя мелиоидоза. 1 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (И) ((1) (s()s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4841531/13 (22) 19.06,90 (46) 15.06.92. Бюл. %22 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) Н.Г.Титова, И.В,Разина, Н.П.Храпова и

М,Я.Кулаков (53) 578.085,23 (088,8) (56) Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 1981, N 4, с.78, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМ ЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L. †.ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛ Ь Н ЫХ АНТИТЕЛ К АНТИ ГЕНУ

PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI, НЕ РЕАГИРУЮЩИХ С БЛИЗКОРОДСТВЕННЫМ

ВОЗБУДИТЕЛЕМ САПА

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения гибридного клона — продуцента моноклональных антител к видоспецифическому антигену

Pseudomonas pseudomailei, До недавнего времени для диагностики, идентификации и дифференциации

Р,pseudomallei использовали абсорбированные "моноспацифические" сыворотки животных к возбудителю мелиоидоза (базовый объект), однако из-за наличия общих антигенов даже после абсорбции они давали перекрестные реакции с близкородственным возбудителем сапа (Р mallei).

Цель изобретения — получение гибридных культивируемых клеток Mus musculus

L., продуцирующих специфические моноклональные антитела к антигену (57) Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния с помощью полиэтиленгликоля клеток мышиной миеломы

РЗ-Х63-А.8.653 с лимфоцитами мышей

Balb/с. Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии АН СССР под номером ВСКК (II)

388Д. Штамм продуцирует моноклональные антитела (МКА) типа IgM, титр МКА в культуральной жидкости — 1:40 — 1;160, в асцитической жидкости — 1:10 — 1:10 . MKA

4 . 5 взаимодействуют с типичными штаммами

Pseudomonas pseudomalleei и не взаимодействуют с типичными штаммами Pseudomonas

mallei. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 28 пассажей без потери активности. MKA используют для идентификации возбудителя мелиоидоза, 1 табл, Pseudomonas pseudomallei, не реагирующих с близкородственным возбудителем сапа.

Новый штамм получен с использованием традиционных приемов гибридомной технологии, Особенностью его создания является то, что для гибридизации (с помощью

ПЭГ) с клетками мышиной миеломы (P3Х63-А8.653) были взяты лимфоциты мышей, первично иммунизированных внутрибрюшинно корпускулярным антигеном

P.pseudomallei (1 10 м.т.) и вторично стимулированных тем же антигеном в культуре

"ин витро" (1 10 м.т./мл). Штамм гибридных клеток ВСКК (II) 388Д депонирован и хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии АН СССР.

1740415

20

30

40

50

Штамм ВСКК (II) 388Д (авторское наименование М.М,Р.ðì 2 (клон 45 С4 В2) имеет следующие характеристики.

Условия культивирования, 1. "Ин витра", в виде стационарной взвеси: температура 37 С, атмосфера с 5

СО и 98 влажностью, среда Искова — Хема — RPMI (1:1:2) с зтаноламином (до 300»» М) или среда RPMI-1640, содержащие 10 сыворотки плода коров, ГЕПЕС (10 мМ), 1-глютамин (2мМ) без антибиотиков или с добавлением до 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина. Клетки (прозрачные, округлые иногда в виде конгломератов, распадающихся при пипетировании) рассевают через 3 — 4 дня с кратностью рассева 1:3—

1:10 (оптимальная посевная доза: 150 — 200 тыс.клеток в 1 мл среды), 2, Пассажи "ин виво" на мышах линии

BALB/с, предварительно обработанных стерильным вазелиновым маслом или пристаном (по 0,5 мл внутрибрюшинно за 7 — 14 дней), осуществляют путем введения, внутрибрюшинно 3 — 5 10 клеток гибридного клона. На 7 — 28-й день в брюшной полости животных развивается асцит. В культуральной жидкости (в системе "ин витро") и в асцитической жидкости (в системе "ин виво") содержатся моноклональные антитела к антигену P.pseudomallei. Титр специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости и ИФА (иммуноферментный анализ) 1:40 — 1:160, в эсцитической жидкости — 1;10 — 1;10, В тесте иммунофлюоресцен4 . 5 ции (при взаимодействии специфических антител с бактериями) высоленные моноклональные антитела дают реакцию с антигеном в разведении 1;20000.

Свойства антител, продуцируемых гибридным штаммом.

Моноклональные антитела относится к классу JgM. Стабильность антителопродукции сохраняется на протяжении 22 пассажей в культуре "ин витро" и на протяжении

28 пассажей при культивировании со сменой "хозяина"("ин вива" — "ин витро" — "ин вива") (срок наблюдения), При сравнительном испытании в ИФА и реакции иммунофлюоресценции (прямой и непрямой) продуцируемые гибридными клетками моноклональные антитела взаимодействуют с антигеном P.pseudomallei u ке взаимодействуют с антигенами близкородственного возбудителя сапа (P.mallei), т.е. обладают строгой видоспецифичностью к возбудителю мелиоидоза. Это было подтверждено и при сравнительном испытании антител с наборами типовых музейных штаммов: антитела реагировали со всеми испытанными типичными штэммами

P.pseudomallei и не реагировали ни с одним из испытанных типичных штаммов Р mallei, Использование продукта полученного нового штамма гибридных клеток — моноклональных антител к видоспецифическому антигену P.pseudomallei, Моноклональные антитела получаютлибо из культуральной жидкости (при культивировании "ин витро"), либо из асцитической жидкости (при культивировании гибридом "ин вива"). Для демонстрации их избирательной (в отношении возбудителя мелиоидоза) специфичности используют метод иммуноферментного анализа, прямой и непрямой иммунофлюоресценции, Иммуноферментный анализ.

В качестве антигена на твердой фазе для сравнительного анализа в ИФА используют водно-солевые экстракты из взвесей инактивированных бактерий (двухсуточные культуры либо Р,mallei либо P.pseudomallei, типичных штаммов, обладающих полным набором антигенов, присущих каждому виду), подвергнутых обработке ультразвуком и осветлению центрифугированием. Для сенсибилизации планшетов используют предварительно подобранные оптимальные дозы суммарных антигенов(20 мкг!мл в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6), сенсибилизация — в течение ночи при 4 С.

В таблице содержатся данные сравнительного тестирования в ИФА продуцируемых гибридными клонами моноклональных антител на разных антигенах (суммарные антигены возбудителя сапа или мелиоидоза), Из таблицы видно, что антитела гибридного штамма взаимодействовали с антигеном возбудителя мелиоидоза и не реагировали с антигенами возбудителя сапа, Лишь в низких разведениях асцитических жидкостей 1;20 — 1:80 возможно положительная реакция на уровне фона, видимо, за счет неспецифического связывания сывороточных антител. В высоких разведениях при наличии положительной реакции со специфическим антигеном перекрестные реакции с антигенами сапа отсутствовали, Не было перекрестных реакций и при тестировании антител гибридного клона из супернатанта культур (при выращивании гибридом "ин витро"). Напротив моноклональные антитела к ЛПС возбудителя мелиоидоза реагировали и с суммарными антителами возбудителя сапа и возбудителя мелиоидоза, демонстрируя факт, что ЛПС является общим антигеном для обоих возбудителей, Взятые в качестве отрицательного контроля моноклональные антитела к дифтерийному анатоксину не реагировали ни с

1740415 одним иэ антигенов. Таким образом, в ИФА с помощью предлагаемых антител возможна дифференциация данных возбудителей.

Метод непрямой иммунофлюоресценции.

На предметных стеклах в два ряда делают мазки из взвесей бактерий возбудителей мелиоидоза и сапа, фиксируют и наносят на них капли серий разведений моноклональных антител. В контроле — заведомо реагирующие (+) или нереагирующие (-) антитела.

Проводят инкубацию во влажной камере, отмывают физиологическим раствором, добавляют меченые флюоресцирующие антитела к иммуноглобулинам мыши в рабочем разведении, инкубируют, отмывают, высушивают, просматривают под иммерсией.

Положительными считают мазки с наличием флюоресценции микробной стенки, При испытании моноклональных антител предлагаемого гибридного штамма установлено, что они не дают флюоресценции при испытании на корпускулах возбудителя сапа и дают отчетливую флюоресценцию корпускул возбудителя мелиоидоза (a разведении до 1:20000).

Метод прямой иммунофлюоресценции, Моноклональные антитела по общепринятой методике конъюгируют с флюоресцеинизотиоцианатом и используют в тесте прямой имуннофлюоресценции с возбудителем мелиоидоза. Установлено, что при конъюгации с флюоресцеинизотиоцианатом специфическая активность моноклональных антител не уменьшается, При анализе серий музейных штаммов обоих возбудителей в тестах прямой и непрямой иммунофлюоресцен ции было установлено, что предлагаемые антитела реагируют с возбудителями мелиоидоза и не реагируют с возбудителями сапа, т.е. обладают выраженнойй видоспецифичностью, Высокая специфичность моноклональных антител, продуцируемых предлагаемым штаммом клеток (видоспецифичность) позволяет в одной реакции (реакция иммунофлюоресценции, ИФА) обеспечить раннюю диагностику, идентификацию возбудителя

10 мелиондоза и его дифференциацию от близкородственного возбудителя сапа. В то время как использовавшиеся ранее для этих целей абсорбированные имоноспецифические" сыворотки к возбудителю мелиоидоэа

15 (базовый объект) дают перекрестные реакции с возбудителем сапа, предлагаемые антитела обладают видоспецифичностью.

Данные антитела (продукт предлагаемого гибридного штамма) можно рассматривать как высокоактивный и специфичный ингре20 диент для постановки реакций непрямой иммунофлюоресценции и как сырье для изготовления флюоресцирующих иммуноглобулинов для постановки реакции прямой иммунофлюоресцении.

Таким образом, новый штамм обеспечивает получение более эффективного препарата, пригодного для идентификации возбудителя особо опасной инфекции — мелиодоза.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., BCKK(ll) N9

388Д вЂ” продуцент моноклональных антител к антигену Pseudomonas pseudomallei, не реагирующих с близкородственным возбудителем сапа.

Результаты тестирования в цфд препаратов моноклональных антител кло а ЛСКК (II) 388 ll (супернатант из культуры гибридных клеток или смесь асцитических иидкостей от ныеей с гибридо вина планыетах сенсибилизированных либо суммарными антигенами возбудителя сапа, либо суннарныни а тигенами возб;дителя нелиоидозя

Бид антител "

Лид анти.-енаа

Оптическая плотность, т100, при разведении антител (обратные величины) 10 (20

Г 40 ) 80 (!60 j 320 f 640 j 1260

-------тп--"--1 Т1

2560 1 5120 i 10240 1 20480 1 40960

3.8 ч.4 6,4 4,5 4,8

P. Рм2 асц.и.

ЛЛС P.Ðì. асц.н.

P.Pì. 2 асц.н.

Р.рн. 2

1,7

20,

20,7

39,5

35,1

12.2

32,2 23,0

3;0 2,4

383023070

26 2 26,2 26,7 26,7

25 5 25 5 27 5 26 0

39,5 42,5 45.5 44 0

33,4 33,3 33,9 Зч,8

11,6 11,6 10,6 9,9 !

4,0 9,4 5,2 2,4

2,0 1,2 0.6 1,0

28,4

24,5

44,5

35,2

8,4

1,0

1,0

28.6 28,7 25,2 !

3,0 3,5 0,5

39,5 31,5 !7,0

33,5 23,7 16,0

6,4 4,9 2.4

0 0

18,2 10,9 Р,ри.

0 0 Р. и.

29,8

21,0

41,5

37,0

7,1

6,5 0,5

11,2 7,2

2,4 0,5

P. Рм.

P.ì.

Р. Рм. супернатант из культуры

0 0

P.ì.

ДАТ

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

P.ì.

P.ì.

0 0

Р.рм, 2 — антитела гибрирного клона к возбудителе мелиондоза; асц.м. - асцитическая ниг,кость; ЛПС P.Ðì. - антлтела к ЛПС возбудителя мелиоидоза; ДАТ вЂ” антитела к дифтирийнону анатоксину; P.è. - антигены возбудителя сапа; Р.Рм. — антигены воабудителя мелиоидоза.