Способ получения аденозинтрифосфата

 

Изобретение относится к биотехнологии , а точнее к способу получения аденозинтрифосфата. Цель - повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт. Сущность изобретения заключается в фосфорилировании аденозина клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae в реакционной среде с содержанием фосфата 0,55 - 0,85 М при рН 7,0 - 7,5. Способ позволяет получить практически 100%-ную конверсию аденозина в АТФ. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 С 12 Р 19/32

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4854987/13 (22) 26.07.90 (46) 15.06.92, Бюл.¹22 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова . (72) Н.С.Симанова, Е.И.Райнина и А,П.Синицын (53) 577.123.38 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 522190, кл. С 07 Н 19/00, 1975.

Авторское свидетельство СССР

¹722920,,кл. С 07 Н 19/20, 1978, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИ НТРИФОСФАТА

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способу получения аденозинтрифосфата (АТФ) с помощью клеток дрожжей рода Saccharomyces, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для получения лекарственных препаратов, а также для получения реактивов для научных исследований.

Известны способы получения АТФ с помощью различных микроорганизмов; пекарских дрожжей, метанольных дрожжей

Candida boidinii, бактерий Brevibacterium

ammoniagenes, Arthrobacter species из аденоэина или аденина в среде, содержащей неорганический фосфат, источник энергии (сахар), источники ионов калия, магния, а также реагент, изменяющий проницаемость клеточных стенок микроорганизмов, например толуол, ксилол. При этом ферментативные системы микробных клеток осущетвляют биофосфорилирование аденозина. Продуктом ферментативного превращения является смесь моно-, ди- и трифосфатов. Выход АТФ в смеси с другими (57) Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способу получения аденозинтрифосфата. Цель — повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт.

Сущность изобретения заключается в фосфорилировании аденозина клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae в реакционной среде с содержанием фосфата

0,55 — 0,85 М при рН 7,0-7,5. Способ позволяет получить практически 100%-ную конверсию аденозина в АТФ. 2 табл. нуклеозидфосфатами не превышает 70%

Выделение АТФ из реакционной смеси осуществляют с применением методов ионнообменной хроматографии.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения АТФ с помощью пивных дрожжей -рода Saccharomyces, согласно которому АТФ получают биофосфорилированием аденозина с помощью пивных дрожжей рода Saccharomyces в ре- 4Ъ акционной среде, содержащей неорганический фосфат (0,16 М), сахарозу, источники ф ионов калия и магния, толуол, подкисляя Я среду ледяной уксусной кислотой до рН 4,5 — 4,8.

Недостатком известного способа является неполное фосфорилирование аденозина и получение смеси продуктов с содержанием 70 — 72% АТФ и 8% АДФ.

Целью изобретения является повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт, Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения АТФ, предусматривающему фосфорилирование аденозина

1740420 в среде; содержащей неорганический фосфат, клетками дрожжей, используют клетки пекарских дрожжей Saccharomyces

cerevisiae и процесс ведут при содержании фосфата 0,55 — 0,85 М, поддерживая в реак- 5 ционной среде рН 7,0 — 7 5.

Способ осуществляют следующим образом.

Saccharomyces cerevisiae культивируют в известных условиях на среде, содержащей 10 глюкозу, дрожжевой экстракт и минеральные соли, Выращенную биомассу помещают в среду, содержащую аденозин, глюкозу, неорганический фосфат, толуол и соль магния. В этих условиях происходит полное 15 фосфорилирование аденозина в АТФ. Оптимальными условиями для получения АТФ является концентрация неорганических фосфатов в реакционной среде 0,55 — 0,85

М и значение рН 7,0 — 7,5. При использова- 20 нии концентрации неорганических фосфатов ниже 0,55 М падает выход АТФ, а .увеличение содержания фосфатов выше

0,85 М нецелесообразно, так как не ведет к изменению выхода и состава продуктов. Из- 25 менение же диапазона рН выше или ниже интервала 7,0 — 7,5 приводит к снижению выхода целевого продукта, В табл.1 приведены данные, показывающие влияние концентрации фосфатов на 30 состав получаемых продуктов фосфорилирования, В табл. 2 — данные, отражающие влияние рН реакционной среды на эффективность биотрансформации.

Пример 1. Культивирование 35

Saccharomyces cerevisiae 14 проводили на среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: глюкоза 2,5; дрожжевой экстракт 2,0; KHzP04 1,0; NaCI 1,0;

М9304х7Н20 0,5; (NH4)zSO4 0,5; рН 6,5 в 40 качалочных колбах объемом 750 мл (объем среды 200 мл) при температуре 30 С и скорости вращения качалки 180 об/мин. Выращенную в течение 20 ч культуру дрожжей центрифугировали 5 мин при 5 тыс. об/мин, Отделенную центрифугированием биомассу переносили в реакционную среду следующего состава: 0,6 М К-фосфатный буфер рН 7,2, 9,4 мМ аденозин; 0,5 М глюкоза; 20 мМ MgS04x7HzO; 0,3 толуол (по объему).

Трансформацию проводили в колбах объемом 100 мл (объем реакционной среды 25 мл) при температуре 30 С и скорости вращения качалки 200 об/мин. При этом практически весь внесенный аденозин превращался в АТФ, примеси АМФ и АДФ составляли менее 1 (степень конверсии

98,5 ). Из 2,5 г/л внесенного аденозина получено 5,1 г/л АТФ.

Анализ продуктов биофосфорилирования проводили с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе фирмы "8iorad", Пример 2. Культивирование дрожжей, центрифугирование биомассы, условия проведения биотрансформации такие же, как в примере 1. Но при этом варьировали концентрацию неорганического фосфата, а также использовали различные штаммы дрожжей, Пример 3, Культивирование дрожжей, центрифугирование биомассы, условия проведения трансформации такие же, как в примере 1, но варьировали исходное значение рН реакционной среды, Формула изобретения

Способ получения аденозинтрифосфата путем фосфорилирования аденозина клетками дрожжей в среде, содержащей неорганический фосфат, сахар, соль магния и толуол, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени конверсии субстрата в целевой продукт, используют клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и фосфорилирование проводят при исходной концентрации неорганического фосфата в среде 0 55 — 0,85.М и рН 7,0 — 7,5.

1740420

Таблица 1

Концентрация фосфатного буфера

Название штамма

Степень био- Количества образовавфосфорилиро- шейся нунлеозилфосвания адено- фатов зина

Saccharomyces

cereeisiae

98,52

0,55М

АТФ - 9,28 мН (АДФ+АМф) < 0,1 мМ

АТФ - 9,32 мМ (АДФ+АИФ) <0,08 мм

АТФ - 9,29 мМ (АДФ АИФ) <0,1 мМ

АТФ - 4,3 мН

АДФ - 2,3 мИ

АИФ - 2,5 мМ

То ме

98,62

0,85М

98, 52

liON

0,4Н

98,42 ч

98,32

0,3М

АТФ - 3,0 мМ

АДФ - 3,0 мМ

АМФ-3 l мМ

0,2М

982

АТФАДФ

АМФ "

1,0 мм

3,5 мМ

4,7 мн

0,25 мМ

2 8 мМ

6,2 мМ

0,15М 982

АТФ "

АДФАМФ982

0;1М

АТФ <0,2 мМ

АДФ - 2,6 мМ

ЯИФ вЂ” 6,4 мМ

ЯТФ - 9,25 мН (Адф+АНФ). < 0, 1 мМ

0,6М

Saccharomyces

cerev isiae раса A(BKM373) 98,48

0,15М

982

То ве

ЯТФ " 0,2 мМ

АДФ - 2,9 мм

АИФ " 6,15 нМ

Таблица 2

Составитель Н.Симанова

Редактор Т,Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5