Способ определения тетрациклинов

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству , в частности к ветеринарии, и может быть использовано при контроле качества меда. Тетрациклины определяют путем добавления к пробе растворителя, нанесения полученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанные 0,1 М раствором трилона Б, с последующей разгонкой пробы в смеси эталацетата с ацетоном. В качестве растворителя применяют смесь 0,005 - 0,015 н соляной кислоты с ацетоном при объемном соотношении пробы соляной кислоты и ацетона 4,0 4- 4.5:1.3 5-4,0 а раствор трилона Б использ ют с рН 4,5 - 4,8 Способ позволяет идентифицировать и определять остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин окситетрациклин, метациклин и доксициклин)на уровне 0 0005% или 0.005 мг на 1 г меда LH

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s 6 01 N 30/90

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4813956/25 (22) 12,04.90 (46) 23,06,92. Бюл.М23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии (72) А.М,Смирнов, Г.Я.Симоненкова.

Н.С.Мороз и А,T.Жунушов (53) 543.544 (088,8) (56) Фармокопейная статья ФС-42-2129-83.

Шаршунова М. и др. Тонкослойная хроматография в формации и клинической биохимии. — М.: Мир, 1980. т.1. с.273. .(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ TETPALIÈÊЛИНОВ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано при контроле качества

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии. и может быть использовано при контроле качества меда, Известен способ определения тетрациклинов (в частности. в сыворотке крови) путем добавления к пробе тетрациклина растворителя, нанесения полученной пробы на пластину для тонкослойной хроматографии, пропитанную предварительно 0,1 М раствором трилона Б, с последующей разгонкой в смеси этилацетата с ацетоном и водой, Однако данный способ не может быть использован для идентификации и определения в меде остаточных количеств тетрациклинов с высокой точностью.

Целью изобретения является повышение точности способа при определении тетрациклина в меде.

„„5U„„1742713 А1 меда. Тетрациклины определяют путем добавления к пробе растворителя, нанесения полученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанные 0,1 M раствором трилона Б, с последующей разгонкой пробы в смеси эталацетата с ацетоном. В качестве растворителя применяют смесь 0,005—

0,015 н.соляной кислоты с ацетоном при объемном соотношении пробы соляной кислоты и ацетона 4,0 4-4.5:1;3.5-4,0. а раствор трилона Б используют с рН 4,5 — 4,8. Способ позволяет идентифицировать и определять остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин и доксициклин) на уровне 0,0005% или 0.005 мг на 1 r меда.

Для достиженгя поставленной цели согласно способу определения тетрацикли ов путем добавления к пробе меда раствори: еля. нанесения полученной пробы на пластину для TQHKocfloAHoA хроматографии. предварительно 0,1 М раствором трилона Е, рН 4,5 — 4.8, с последующей разгонкой в смеси зтилацетата с ацетоном и водой. в ка естве растворителя используют смесь

0,005 — 0,015 н,раствора соляной кислоты и ацетона в объемном соотношении пробы, соляной кислоты и гцетона 4.0 -- 4.5:1:3.5—

4.0.

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка к анализу.

Для приготовления 0,1 М растьора трилона Б 3,76 г трилона Б вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в небольшом количе:тве воды. объем раство1742713 вания (ТУ 15/16 3ССР-7-88) многоразового 40

55 ра в колбе доводят до метки водой, перемешивают. рН полученного раствора должен быть 4,5 — 4,8 (проверяют потенциометрически), при необходимости рН раствора доводят до нужного значения 10%-ным раствором едкого натра.

Приготовление стандартных растворов тетрациклинов.

По 50 мг каждого антибиотика (тетрациклин,окситетрациклин, метациклин и доксициклин) вносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл

0,01 -н. соляной кислоты, встряхивают до полного растворения, затем объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном. Вносят

5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора в колбе до метки ацетоном (раствор 1), Приготовление стандартного раствора доксициклина для определения всех тетрациклинов.

Вносят50MI доксициклина гидрохлорида в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 0,01 н.раствора соляной кислоты, встряхивают до полного растворения, объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном, перемешивают. Вносят 5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном (раствор 2), Подготовка пробы меда для анализа.

К 4,0 — 4,5 мл (4,5 — 5,5 г) меда в колбе с притертой пробкой прибавляют 1 мл 0,005—

0,015 н.соляной кислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляк т 3,5 — 4,0 мл ацетона, перемешивают (раствор 3).

Подготовка и регенерация хроматографических пластин, Готовые пластины для хроматографироиспользования размером 6х10 см помещают на 30 мин в 0,1 M раствор трилона Б (рН

4,5 — 4,8) для пропитывания. Пластины вынимают, сушат на воздухе в течение 2 — 3 ч и помещают в сушильный шкаф на 1 ч при

105 — 110 С для активирования. Охлажденная пластина готова для анализа.

После проведения хроматографического анализа пластины регенерируют, помещая их в раствор хромовой смеси (осторожно) на 5-10 мин, пинцетом вынимают и переносят в сосуд для промывания в проточной воде в течение 30 мин, Окончательно каждую пластину промывают дистиллированной водой (100 мл), высушивают на воздухе, затем пропитывают раствором трилона Б и активируют, как указано выше, 5

Приготовление подвижной фазь1 (система растворителей) для хроматографирования.

В мерном цилиндре с притертой пробкой вместимостью 50 — 100 мл смешивают

20 мл зтилацетата, 19 мл ацетона и 3 мл воды, подвижную фазу выливают в хроматографическую камеру с притертой крышкой, Выполнение анализа.

На линию старта стеклянной пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см одна от другой и на 1,5 см от края нижнего пластины;

5 мкл раствора 1 (0.1 мкг каждого антибиотика);

5 мкг раствора? (0,1 мкг дексициклина);

5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда).

Пластину с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 1 — 2 мин, помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат;ацетон:вода (20;19:3) и хроматографируют восходящим способом.

Когда фронт растворителей поднимется на 7 — 8 см от линии старта, пластину вынимают иэ камеры, сушат на воздухе 10 мин, потом 5 мин в сушильном шкафу (при 100 С), После охлаждения пластину помещают на 3 — 5 мин в камеру с парами аммиака и затем просматривают в свете лучей УФ-лампы при длине волны 366 нм. На хроматограмме должны быть видны 4 эоны антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 1, MBTB цикл ин с Йзио дсксицик

=0,47+ 0,05; тЕтРациклин с Rsno доксицик.=

=0,76 + 0,05; доксициклин с Rsno доксицлк. =

=1,0 +.0,05 и окситетРациклин С Rsoo доксицик

= 1,18 +- 0,05, Сравнивают интенсивность свечения зон пятен веществ, полученных при хроматографировании раствора 3 (проба меда), нанесенного в разных количествах (от

5 до 20 мкл) с помощью микрошприца или пипетки с интенсивностью свечения зон пятен веществ, полученных при хроматографировании раствора 1. Интенсивность зон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 3, должна быть не более интенсивности эон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 1.

Обнаруженное количество каждого антибиотика в пробе меда по предлагаемому способу составляет 0,0005% или 0,005 мг на

1 r меда, Пример 1. Помещают 4,0 мл меда (образец 1) в колбу с притертой пробкой, прибавляют 1 мл 0,005 н,солян . кислоты, перемешивают, растирают, добавляют

1742713

Формула изобретения

50

Составитель В. Толстых

Редактор В. Петраш Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор Т, Палий

Заказ 2281 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

3,5 мл ацетона. Пластины для хроматографирования подготавливают так же, как указано выше, но рН 0,1 М раствора трилона Б равен 4,5; сушат на воздухе 2 ч и активируют при 105 С, На пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см одна от другой, 5 мкл раствора 1 (приготовление стандартного раствора тетрациклинов описано выше);

5 мкл раствора 2 (приготовление стандарта доксициклина для определения тетра цикл и на описано вы ше);

5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда), При просматривании пластин после хроматографирования в свете УФ-лампы обнаружен окситетрациклин, интенсивность зоны свечения которого соответствует 0,01 мг антибиотика на 1 г меда.

В примере применяли 3 пробы меда, При использовании для определения остаточныхх количеств тетрациклинов известным способом не было обнаружено тетрациклинов ни в одной из проб.

Пример 2. Определение осуществляют одновременно на 3 пробах меда (образец 2).К 4,5 мл меда в колбе с притертой пробкой прибавляют 1 мл 0,015 н.соляной кислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляют 4,0 мл ацетона.

На линию старта подготовленной как указано выше хроматографической пластины, но с пропитыванием 0,1 М раствором трилона Б при рН 4,0 и сушке на воздухе

3 ч при активировании в шкафу со 110 С, нанося-. следующие пробы в точки:

5 мкл раствора 1 (стандарт — смесь тетрациклинов);

5 мкл раствора 2 (стандарт доксициклина);

5, 10 и 20 мкл раствора меда.

При просматривании пластины под УФлампой после процесса хроматографирования не обнаружено зон свечения тетрациклинов.

Пример 3. Берут 3 пробы меда (образец 3) по 4,25 мл, к каждой пробе прибавля5 ют 1 мл 0,01 н.соляной кислоты и 3,75 мл ацетона, далее все операции проводят как в примерах 1 и 2. Пластины пропитывают тем же раствором трилона Б, но рН 4,65, сушат на воздухе 2,5 ч, активируют при 107 С. На

10 пластину наносят пробы в той же последовательности и количествах,.как в примерах

1и2.

После проведения процесса хроматографирования и просматривания пластины в

15 свете УФ-лампы обнаружена зона свечения окситетрациклина, интенсивность которой соответствует 0,005 мг антибиотика на 1 г меда, Способ позволяет идентифицировать и

20 определить остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин и доксициклин) на уровне 0,0005 или

0,005 мг на 1 г меда.

Способ определения тетрациклинов путем добавления к пробе, содержащейтетра30 ци клин, растворителя, на несения полученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанных 0,1 М раствором трилона Б. с последующей разгонкой пробы в смеси зти35 лацетата с ацетоном, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа при определении тетрациклина в меде, в качестве растворителя используют смесь

0,005 — 0,015 н.соляной кислоты с ацетоном, 40 взятых в объемном соотношении проба:соляная кислота:ацетон, равном 4,0—

4,5:1:3,5 — 4,0, а раствор трилона Б используют с рН 4,5 — 4,8.