Рекомбинантная плазмидная днк @ rv7-ii, содержащая фрагмент @ rv7-ii для выявления ротавирусов человека, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент фрагмента @ rv7-ii для выявления ротавирусов человека

 

Изобретение относится к медицине, генетической инженерии и биотехнологии. Целью изобретения является создание штамма Escherichia coll - продуцента ДНК- зонда для выявления ротавирусов человека. В результате генноинженерных разработок создан штамм E.coll Nfe BKMCR-317D, содержащий плазмиду pRV7-ll - продуцент фрагмента dRV7-ll ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека. Синтезированный фрагмент выявляет в реакции РНК-ДНК гибридизации ротавирусы человека как с длинными, так и с коротким типами миграции сегментов РНК и обладает чувствительностью 0,1-0,5 нг тотальной РНК для ротавирусов человека и 1 нг РНК гетерологичного ротавируса SAII. Использование фрагмента dRV7- l для индикации ротавирусов человека в клиническом материале позволяет выявить ротавирусы в большом количестве проб по сравнению с методами электронной микроскопии и электрофореза геномной РНК. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 2 табл. (Л

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

isi)s С 12 и 15/33. 15/70

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4774640/13 (22) 26,12.89 (46) 30.06;92. Бюл. N. 24 (71) Нижегородский научно-исследователь-. ский институт .эпидемиологии и микробиологии и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.А.Новикова, Л.А.Кулаков, В.Н.Ксензен ко, Н.В. Носкова и H.Â. Е пифа нова (53) 575;224,2.577.2 (048) (088.8) (56) Both G.W. et.al — NAR. 1982. 10, рр..70757089. .Dyall Smith МЛ. et.al — NAR, 1983, 11, рр,3351-3362, (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pRV 7-И, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ

dRV7-II ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РОТАВИРУСОВ

ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERlCHlA СОВ-ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА бРЧ7-И ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РОТАВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к медицине. генетической инженерии и биотехнологйи.

Ротавирусы являются этиологическим . агентом острого гастроэнтерита, паражают преимущественно детей раннего возраста и молодняк животных, вызывают в осеннезимний период до 70 случаев острых кишечных инфекций неясной этиологии.

Разработка современных способов выявления ротавирусов имеет большое научно-практическое значение, так как своевременная диагностика важна для выбора правильной стратегии лечения больного и необходима для проведения

;„, 42 „„174411 1 A l (57) Изобретение относится к медицине, генетической инженерии и биотехнологии, Целью изобретения является создание штамма Escherichia соП вЂ” продуцента ДНКзонда для выявления ротавирусов человека, В результате генноинженерных разработок создан штамм Е,coll N. .BKMCR-317D, содержащий плазмиду pRV7 — II — продуцент фрагмента dRV7 — 11 ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека. Синтезированный фрагмент выявляет в реакции

РНК-ДНК гибридизации ротавирусы человека как с "длинными", так и с "коротким" типами миграции сегментов PHK и обладает чувствительностью 0,1-0,5 нг тотальной

РНК для ротавирусов человека и 1 нг PHK гетерологичного ротавируса SAll, Использование фрагмента dRV7 — П для индикации ротавирусов человека в клиническом материале позволяет выявить ротавирусы в большом количестве проб по сравнению с методами электронной микроскопии и электрофореза геномной PHK. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 2 табл. эпидемиологического изучения инфекции, вызванной ротавирусами."

Ротавирусы характеризуются широкой вариабельностью и многообразием генетических вариантов; что определило существование различных групп, субгрупп и серотипов ротавируса. Существующие в настоящее время иммуноферментные тест-системы, основанные на групповом и субгрупповом антигенах, не позволяют выявить все многообразие вариантов ротавирусов. Кроме того, иммуноферментный метод при анализе проб стула больных ро-. тавирусным гастроэнгеритом дает опреде1744111 ленный процент ложноположительных результатов, Одним иэ наиболее чувствительных и специфических методов индикации вирусов является метод молекулярной гибридизации, Геном ротавирусов состоит из !!сегментовв двунитевой РНК. Известно, что гены, кодирующие неструктурные белки (ГНБ), могут гибридизоваться с РНК различных штаммов ротавируса.

Установлено, что степень гомологии одного и того же ГНБ у разных штаммов ротавируса может колебаться от 74 до 88%, Разброс в чувствительности по отношению к разным штаммам ротавируса связан с дивергенцией нуклеотидных последовательной генов.

Кроме того, показано, что при применении в качестве "зонда" ДНК комплементарной РНК вирусов, циркулирующих в разных географических регионах, возможно отсут-, ствие выраженного гибридизационного сигнала из-за дивергенции нуклеотидных последовательностей, В связи с этим создание эффективного

"зонда" для выявления в клиническом материале ротавирусов человека, циркулирующих на определенной территории. предполагает использование РНК, доминирующих на данной территории штаммов.

Известны рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты ДНК, комплементарные ГНБ ротавирусов обезьян (штамм

SA11) свиней (штамм QSU)i и крупного рогатого скота (штамм UK), созданные на основе вектора pBR 322. Использование данных гибридных плазмид для выявления ротавирусов человека неэффективно, так как они несут фрагменты генетического материала штаммов ротавируса, гетерологических по отношению к ротавирусам человека.

Известен способ конструирования гибридных плазмид, содержащих ДНК, комплементарные сегментам генома ротавируса.

При конструировании в качестве вектора использовалась плазмида pBR 322. Клонирование проводилось в Pst l сайт данной плазмиды. Известно, что при использовании такого способа конструирования 50% целевых плазмид теряют Рзт1-сайт, в результате чего возникают сложности получения клонированной последовательности.

Известен способ получения рекомбинантных плазмидных ДНК на основе вектора р0С. Однако неизвестна возможность применения такого способа при клонировании флагментов ДНК, комплементарных генам ротавируеов, кодирующим неструктурные белки.

Известны штаммы Escherichia coll, содержащие рекомбинантные плазмиды с кДНК ГНБ ротавирусов обезьян и животных, Использование этих клеток в качестве продуцентов гибридизационного, зонда для выявления ротавирусов человека нецелесообразно в связи с тем, что содержащийся в них генетический материал недостаточно эффективно гибридизуется с

PHК ротавирусов человека (1,2), Цель изобретения — создание штамма

Escherlchia coli-продуцента ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека, Поставленная цель достигается тем, что:

А, Выделяют днРНК ротавируса человека, доминирующего на территории РСФСР.

Б. Синтезируют ДНК фрагмент dRV7 — II, комплементарный 7-му сегменту генома ротавируса человека, кодирующему неструк20 турный белок

В, Конструируют плазмиду pRV7 — 11, в которой синтезированный фрагмент кДНК встроен a Pstl сайт полилинкера плазмиды

pUC 9.

Г. Предлагают способ конструирования рекомбинантной плазмиды pRV7 — II, позволяющий введение ДНК, комплементарной

7-му сегменту генома ротавируса человека

a Pstl сайт плазмиды pUC 9.

Д, Создают штамм Escherichla coli, содержащий плазмиду pRV7-И-продуцент

5

40 универсального зонда для выявления ротавирусов человека.

Сущность предлагаемых объектов изобретения состоит в следующем, А, ДНК-зонд dRV7-Ii для выявления ротавирусов человека представляет собой

Pstl — Pstl фрагмент ДНК, гомологичный 7-му сегменту P H К генома ротавирусов человека, Фрагмент имеет размер 1,113 т.п,н., первичная последовательность представлена на фиг. 2. ДНК-зонд бВЧ7-li гибридизуется с РНК штаммов ротавируса, имеющих разные типы миграции PHK.

Синтез ДНК зонда dRV7-II осуществляется в процессе репликации плазмиды

pRV7 — II за счет участка инициации репликации плазмиды.pUC 9.

Б. Плазмида pRV7 — II (фиг.1) состоит из: — Pstl — Рsti фрагмента ДНК (dRV7 — 11) размером 1,113 т.п,н. с определенной пОследовательностью; — Pstl-Pstl фрагмента ДНК векторной плазмиды pUC 9 размером 2 671 т,п.н. и имеет: уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Есор!, Smal, Xmal, Bam Hl, Sal Gl, Accl, Hincl, Hindlll;

1744111.

25

35

45

55 два сайта рестрикции для эндонуклеазы

Psst; три сайта рестрикции для эндонуклеазы

НаеИ;ого репликации плазмиды pUC 9, селективный маркер Ap ; область, кодирующую а -пептид р-галактозидазы, синтез которого инактивирован встройкой бйЧ7-II фрагмента кДНК.

В; Сущность способа конструирования рекомбинантной плазмиды заключается в том, что к У-концам смеси синтезированных фрагментов кДНК генома ротавируса человека с помощью терминальной трансферазы присоединяют по 20-30 остатков цитоэина. Аналогично к вектору pUC 9, гидролизованному по Pstl сайту, присоединяют 20 — 30 остатков гуанина, Затем полученные таким образом ДНК вектора и фрагмента сплавляют. Полученной смесью

ДНК трансформируют клетки Eschertchta

colt 285 и выращивают при 37 С на среде, содержащей ампицилин, .бром-хлор-индолилгалактозид и изо-пропил-тиогалактоэид, Отбирают клоны, образующие колонии .белого цвета, из которых выделяют плазмиду

ДНК и идентифицируют целевую плаэмиду по гибридизации с седьмым сегментом PHK ротавируса человека.

Г. Штамм продуцент ДН К-зонда для выявления ротавирусов человека получают трансформацией клеток E.coll 2 85 с помощью рекомбинантной плазмиды pRV7-II.

Штамм бактерий Escherichia coll, содержащий плазмиду pRV7 — It, депонирован во

Всесоюзной коллекции микроорганизмов под N. ВКМ CR-317D, характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные (1,2-1.6 х 2.0 х х 6,0 мкм), подвижные, имеют перитрихи альные жгутики, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. На 1,5% питательном агаре

Дифко колонии гладкие, серые, бестящие, края ровные, мутные. При выращивании в жидких средах — мясопептонном бульоне и

L-бульоне образуют ровную интенсивную . муть.

Физико-биохимические признаки, оптимальная температура 37 С. рН 6,8-7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота используют минеральные соли (в амонийной или .нитратной форме), органические соедийения (в .виде пептона. триптона. аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам: проявля ет устойчивость к ампицилину (100150 мг/л), Генетические признаки: F Л!ас М15.

Присутствие в штамме Е.coll ДНК плаэмиды pRV7 — И, содержащей фрагмент д RV7II, гомологичный 7-му сегменту PHK генома ротавируса человека, подтверждается путем проверки его устойчивости к ампицилину, а также путем выделения и анализа плазмидной ДНК, а затем с помощью блотгибридиэации, Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Конструирование ДНКзонда для выявления ротавирусов человека.

А. Выделение очищенной PHK ротавирусов человека.

РН К ротавирусов человека выделяют из инфекционного материала больного ротавирусным гастроэнтеритом (изолят N 4097), содержащего ротавирусы с "длинным" типом миграции PHK. Ротавирусы с таким электрофоторетипом доминируют на территории РСФСР в течение ряда лет. . 1 г инфекционного материала гомогениэируют в 3 мл буфера, содержащего 0,01 M

СНзСООКа, 0,3 M NaCI, 4 м M ЭДТА, рН 5,2, 1% ДСН, инкубируют 1 ч при 37 С, добавляют равный объем прогретой до 65 С фенол-хлороформенной (1:1) смеси, перемешивают и инкубируют 3 —.5 мин при

65 С. Смесь центрифугируют при 5 тыс.об. в 1 мин в течение.10.мин и отбирают супернатант. Экстракцию noBTopAloT еще раз при 65 С, а затем при комнатной температуре аналогично описанному выше, . К полученному препарату добавляют 2 объема этанола, выдерживают 18 — 20 ч при

-20 С и центрифугируют при 5 тыс.o6/мин в течение 1 ч. Осадок растворяют в 1 мл буфера. содержащего 0,01 M трис рН 8.0, 0,001М

MgCIz, 0.3 М NaCI, 20 мкг/мл панкреатической ДН Казы, инкубируют 30. мин при 25 С, добавляют равный объем фенола (pH 8,0), интенсивно перемешивают и центрифугируют.при 5 тыс.об /мин в течение 10 мин, Водную фазу отбирают, добавляют 0,1 объема 3 М ацетата натрия и два объема этанола. Осадки РНК, сформированные при -20 С в течение ночи. дважды промывают 70%ным этанолом с 0,05 М ацетатом натрия рН

5,2, растворяют в стерильнньй воде и переосаждают еще раэ. Осадки PHK хранят при

-20ОС, Б. Синтез двух цепочечной кДН К.

Синтез кДНК осуществляют по известному методу Мак-Крас.

Препарат днДНК(5 — 10 мг) в буфере, содержащем 10ММ трис-HCI. рН 8,00 1 мМ

1744111

ЭДТА (ТЕ),денатурируют при 100 С 5 мин и охлаждают при 0 С;

Реакцию полиаденилирования 3 концов РНК проводят в объеме 200 мкл при

37 С в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС! 5 рН 7,9,10 мМ MgCtg. 2,5 мМ МпС!г, 20 мМ

NaCI, 50 мкг/мл БСА, 0,1 мМ АТФ (включая

20 мк КиНзАТФ и 1/10объема поли-А-полимеразы (0,5 мкг)).

Степень аденилирования определяют 10 по известной методике, Определяют время реакции, необходимое для присоединения

15 — 20 остатков АМФ. Полученный препарат экстрагируют фенолом и осаждают 2,5 объемами спирта. 15

К препарату полиаденилированной PH К в буфере TE добавляют 5 мкг олиго-dT<2->8„ денатурируют 3 мин при 100 С и охлаждают во льду. Синтез кДНК проводят в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 8,3, 50 мМ 20

КС1, 10 мМ М9С!г, 10 мМ ДТТ, 4 мМ пирофосфата натрия, по 0,5 мМ d ATP, d СТР, dG

TP, d TTP, 10 мк Ки Р ATP в объеме реакционной смеси 100 мкл. Добавляют 25 ед,обратной транскриптазы из вируса мие- 25 лобластоза птиц и инкубируют 2 ч при 42 С, Цепи РНК удаляют щелочным гидролизом (0,25 М NaOH 20, при 70 С). Препарат нейтрализуют HCI, депротеинизируют равным объемом фенола(рН 8,0), осаждают нук- 30 леиновую кислоту этанолом и растворяют в

50 мкл ТЕ-буфера.

Препарат очищают от невключившихся

dNTP на колонке с сефадексом 6 50, уравновешенной ТЕ-буфером, Отбирают фрак- 35 ции, содержащие кДНК. Для i получения дн кДНК полученный препарат прогревают

2 мин при 100 С, добавляют до 0,2 М и отжигают комплементарные молекулы ДНК

30 при 65 C,60 ïðè50 С,30 при 40 С.Дву-40 иитевую кДНК осаждают этанолом, Достройку дн кДНК до образования "тупых" концов проводят с помощью фрагмента Кленова по стандартной методике, Затем проводят экстракцию фенолом и хроматог- 45 рафию на колонке с сефадексом 6-50.

Фракции, содержащие кДНК. объединяют, кДНК осаждают этанолом.

Реакцию достройки поли-G-коннекторов проводят в 25 мкл инкубационной смеси 50 следующего состава: 0,2 M какодилат N8, рН

7,9, 8 мМ МоС!г, 1 мМ Р -меркаптоэтанола, 2 мМ СТР. В реакционную смесь добавляют

20 ед, концевой нуклеотидилтрансферазы и

0,5 мкг дн кДНК. Реакцию проводят при 55

37 С в течение 30 мин, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом, как указано выше, Пример 2. Клонирование к ДНК в векторной плазмиде pUC9

А. 5 мкг векторной плазмиды pUC9 гидролизуют рестрикционной нуклеазой Ps

Достройку поли-G-коннекторов проводят при 37 С 30 мин, как указано (за исключением того, что вместо d СТР берут dG TP, а вместо М9С!г - СоС!г), Плазмидную ДНК и дн кДНК смешивают в эквимолярных соотношениях в 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН

7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCI.

Инкубируют 5 мин при 65 С, затем 2 ч при 42 С и охлаждают до 0 С. Полученным препаратом ДНК трансформируют компетентные клетки Е,coll Z85, Иэ выросших при 37 С клонов трансформантов белого цвета выделяют плаэмидную ДНК щелочным методом.

Б. Рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды рВЧ7-II, Выделенные плазмидные ДНК расщепляют эндонуклеазой рестрикции Pstl.

Полученные препараты анализируют в

1 -ном агарозном геле, По данным рестрикционного анализа отбирают плазмидые ДНК, содержащие различные по размеру вставки.

Пример 3. Идентификация рекомбинантной плазмиды pRV7 II, содержащей универсальный зонддля выявления ротавирусов человека.

Идентификацию рекомбинантной плазмиды, .содержащей вставку ДНК, комплементарную 7-му сегменту PHK генома ротавирусов, проводят методом блот-гибридизации..

Радиоактивные зонды для гибридизации получают по стандартной методике.

Плазмидную ДНК очищают от невключившихся дезокситрифосфатов на колонке с ефадексом 650 medium.

С целью нанесения сегментов PHK на нейлоновую мембрану проводят электрофорез PHK ротавирусов человека в ПААГ, Готовят гелевую ячейку 115х115х2, состоящую из IO Д разделяющего и 3 Д концентрирующего гелей, Гели. готовят иэ. концентрированных растворов: 30 акриламид-бисакриламид(27: I), х 4-кратного буфера для разделяющего геля (1,5 М трис-НС!, рН 8,4, 0,4 ДСН), х 4-кратного буфера для концентрирующего геля (0,5 М трис-НО, рН 6-8, 0,4 ДСН), воды, катализатора (10 -ный персульфат аммония! и инициатора полимериэации (N-N-N — N-ТЭМЭД), Перед гибридизацией мембрану предгибридиэуют 2-3 ч при 42 С в растворе, 1744111.

10 содержащем 5х SSC, 50 мМ фосфата Иа (рН 6,5), 500 мкг/мл денатурированной при

100 С в течение 10 мин тимусной ДНК, 0,1%

ДСН, 0,1% БСА, поливинилпиролидона и фикола. После предгиб0идизации в раствор добавляют меченную Р денатурированную

ДНК рекомбинантной плазмиды и проводят гибридизацию при 55 С 24 ч, после чего мембранный блот отмывают 4 раза по. 10 мин при комнатной температуре в 200 мл

2xSSC 1 ДСН и 30 мин при 550С в растворе 0,1% SSC — 0,1% ДСН, высушивают и радиоавтографируют при -70 С в течение

24 ч. На основании данных радиоавтографии идентифицируют целевую плазмиду

pRV7-ll, содержащую фрагмент ДНК. комплементарный 7-му сегменту P HK ротавируса человека.

Пример 4. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ойЧ7II.

А. Получение производных фрагмента

dRV7 — II, укороченных с Hind Ill-конца.

ДН К плазмиды рйЧ7-И (2 мкг) гидролизуют эндонуклеазой, рестрикции Hind 1И (5 ед.) в буфере: 10мМ трис-HCI, рН 7,5,50 мМ

NaCI. 10 мМ MgC4. 1 мМ ДТТ в объеме реакционной смеси 40 мкл в течение 2 ч при

37 С. Препарат экстрагируют равным объемом фенола, осаждают 2,5 объема этанола и растворяют полученный осадок в IO мкл бу фера ТЕ.

Полученный препарат обрабатывают нуклеазой Bal 31 (2 ед.) в 20 мкл буфера:

20 мМ трис-HCI рН 7,3, 0.6 М йаО, 12,5 мМ

М9С!й, 12.5 мМ СаС!г при 30 С в течение

10 мин. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до 20 мМ, препарат экстрагируют фенолом, осаждают 2,5 объемами этанола и после промывают 70%-ным этанолом в оеадок растворяют в 20 мкл ТЕ. Гидролизуют

ДНК эндонуклеаэой рестрикции Есо81. (5 ед.) в 30 мкл буфера . 100 мМ трис-НО рН

7,5, 100 мМ NaCI, 10 мМ МдОг. 1 мМ ДТТ при 37 С 2 ч. Препарат подвергают электрофорезу в 0,9%-ном агарозном геле. Набор укороченных с Hind 1И-конца фрагментов

ДНК вырезают и элюируют из геля с по мощью электроэлюции.

Полученные фрагменты ДН К клонируют в плазмиде рОС9 (предварительно гидролизованной эндонуклеазами рестрикции

EcoRI и Sma1) по известной методике. Клоны анализируют на. наличие плазмидной ДН К с помощью электрофореза в агарозном геле и отбирают клоны, несущие плазмиды с делециями фрагмента dRV7-.È размером 200.

300, 400 и 500 н.п.

Б, .Получение производных фрагмента

dRV7-ll, укороченных с EcoRI-конца.

20 дизации

30 нитевых PHK в полученных .препаратах

5.5

Аналогично получают делеции фрагмен та dRV7 — tl с EcoRI-конца, для чего ДНК плазмиды pRV7 — И первоначально гидролизуют эндонуклеазой рестрикции ЕсоЮ.

В. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента 4ВЧ7-И.

Плазмиду pRV7-ll, а также плазмиды с делеционными производными фрагмента

dRV7 — И гидролизуют соответствующей зндонуклеазой рестрикции (Hind III или EcoRI).

Концевое мечение фосфором-32 полученйых прегаратов ДНК осуществляют с помощью ДН К-полимеразы(фрагмент Кленова) по известной методике. Выделение и очистку меченого . фрагмента ДНК проводят как описано выше. Нуклеотидную последовательность меченых; фрагментов определяют по методу Максама — Гилберта, Полученная в результате полная нуклеотидная последовательность фрагмента dRV7-И представлена на фиг.2, Пример 5. Определение эффективности фрагмента dRV7 — И методом дот-гибриВыделяют PHK ротавирусов человека, имеющих "длинный" (И субгруппа) и "короткий" (! субгруппа) типы миграции сегментов, а также PHK ротавируса SAII, как описано в примере 1, Определяют концентрацию двуспектрофотометрическим методою (7 сегмент PHK по мол.м. составляет 1/20 часть массы тотальной РНК ротавириона).

5 нг тотальной PHK каждого типа денатурируют при 100 С втечениебмин в20мкл буфера ТЕ, быстро охлаждают во льду, наносят на нейлоновый фильтр, пщвдгибридизуют, гибридизуют смВчаййЮ Р ЫДНК-зонда и радиоавтогрефируют, как описано в примере 3. Идентифицируют зоны гибридизации для РНК различных ротавирусов

Результаты представлены в табл. 1.

Наличие гибридизационного сигнала наблюдается во всех случаях. Для проведения гибридизации также использовалась PHK в количестве от 2 до 0,1 нг.

Пример 6. Выявление ротавирусов человека в клиническом материале больных острыми кишечными инфекциями с применением фрагмента dRV7-И методом дотгибридизации, Берут 100 мкл копроэкстракта, добавляют 0,25 объема 25% ДСН, выдерживают 3 мин при 60 С, добавляют 3 объема 100% в! ч перхлората натрия, смесь интенсивно встряхивают и центрифугируют 10 мин при

5 тыс.o6/мин. Не менее 20 мкл водной фазы наносят ха нейлоновый фильтр, предгибридизуют с P -меченым фрагментом dRV7-ll, 32 как описано выше.

1744111

O г . ((4(((2222222222222

6GC T2 T TAAA6C,2C 2 A6TC ССС С 2ТТСАСС С l ТСС 6624ТЛССС ЛТС GC ТСЛСС TAGC

° 100 ° °

TTGC ТТТТСТТАТССТСАТТТССЛСЛЛС GATAGC ТЛТЛЛЛТТТЛТТСС ТТТТЛЛСAGTTТ.

+ Ф

AGCААТЛЛЛЛТ6ТАТ6ТТ6ЛСЛССТЛЛЛСТССЛТЛЛЛЛЛЛ4ЛТСАЛСЛТЛЛЛТТТТАСЛЛ

° Ф °

Ю

ТТСТАТТС222АТССААТТСС GCСЛССАСААСЛАТТ2АЛЛАЛЛССТТЛТЛЛТЛСTAGTGA

° 300

TAA22CGA6AG6AATGAA2TATGAAACGAТТЛТС2ТТЛАТЛЛОСТСОС1С2СТТЛАТТТО.

Ф Э ° .

ТСААССАС TTAATTCЛАТСААЛСТСAC ACAATC ТСЛЛЛТТССЛЛЛТСТТСТТТСЛАСЛСТ

А6222С262ТЛСАСАТТТССЛЛЛЛТТТЛ42МКТСЛ4ААЛ1.СИи Х2САТС ЬЛСЛС СТАС2

°

ТТТТСАТТССЛЛАСЛЛСТЛСТС ТТЛЛЛЛТС 626i TAATAGC ТЛТ266ТСАЛТСААААСА

500 " ° ° ° е

AAT2GAAAC 2ËÑ ТСС ТЛС ТССССЛЛССАССЛСЛЛАТЛСТА222СЛСААТССАСС TTTTAC

TATG2GGAAATTGAC TTA2l ТАСАТС АТАЛАТТАЛТСС С 2ЛТTTTG GACC AGAATTTCAT

4 . TGAATATAAAATTACАТТСАЛТСЛАСЛТЛААССАА222САСА26ТЛТ6Т6ТСАЛАСЛССТ

° 700 °

TGTTGCTGAATThAGATGGChGTACAACAGATTTGCТСТЛЛ2АЛСЛСЛТ6СТАЛАООТСЛ о 4

С i ATAGAGТТСТТЛЛЛТЛТТСЛТCh GTTGC ТЛЛС СЛТС САСЛТЛСЛСТС2ТТСС ТЛСЛТЛ

° 000 ° °

ТАЛСЛЛТЛЛТ4СТЛЛ4ЛС24(lюТЛЛТЛТТЛСТСЛСТТСЛЛТТТ(гТТЛ(A(СAAAUСЛТТЛТ

-900 °

226ССААЛЛ22662АСССАТ CACATCТТСЛАТСЛААСАЛССТААТАСЛАТТСАТАТА26

Анализируют 60 проб стула больных кишечными инфекциями, ранее обследованных на ротавирусы методами электронной микроскопии и злектрофореза в ПААГ, Результаты представлены в табл, 2, Из табл. 2 видно, что применение метоll а молекулярной гибридизации с использованием в качестве зонда фрагмента dRV7-И позволило выявить ротавирусы во всех пробах, положительных по методу электронной микроскопии, и в трех пробах, отрицательных по этому методу.

Таким образом, в результате генноинженерных разработок создан штамм Е.соИ

М ВКМ Ся-3170, несущий рекомбинантную плазмиду — продуцент dRV7 — И фрагмента

ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека с различными типами РНК методом

ДН К-Р Н К гибридизации.

Синтезированный фрагмент dRV7 — И выявляет РНК ротавирусов различных субгрупп за счет того, что является копией гена, кодирующего неструктурный белок и консервативного у всех имеющихся штаммов ротавируса. Чувствительность фрагмента

dRV7-И составляет для PHК ротавирусов человека 0,1-0,5 нг, что выше, чем в случае фрагмента, синтезированного на матрице генома ротавируса $АИ, эа счет того, что фрагмент dRV7-II является копией гена ротавируса человека.

Использование фрагмента dRV7-II для выявления ротавирусов человека в клиниче-: ском материале позволило повысить процент выявленных положительных на . ротавирусы проб по сравнению с методом электронной микроскопии, что может быть

1О связано также с тем, что фрагмент dRV7-II синтезирован на матрице генома штамма ротавируса человека, доминирующего на территории РСФСР, и имеет первичную структуру, наиболее распространенную на

15 данной территории, Созданная плаэмида рйЧ7 — И позволяет нарабатывать фрагмент бйЧ7-II. Уровень синтеза зонда в составе плазмиды в сконструированном штамме E.colt и BKM Ся-317D составляет при плотности культуры

5х10 клеток ./мл 1,5 мгlл.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pRV7 — И, содержащая фрагмент бйЧ7-II для

25 выявления ротавирусов человека, содержащая: Pstl —. Pstl-фрагмент ДНК dRV7-И размером 1,113 т.п.н., гомологичный 7-му сегменту РНК ротавируса человека, со следующей нуклеотидной последовательно, стью.

1744111

TAAGAAAG 26С TG TTTC AAA АСАХ САААСААСАСААИЛЛС С С ЛТХХЛААС СА726ТСАЛС

° 1000 е ЯЛСАЬАЛАЬА2ССЛлЖЛЛБХАХСЛСМ. Г22МЛЛТГХЛЛТТССС 12ТС4Ы, .2СЛЛЛЛЛ2

Ф е е

GATGATGAC GAAGC AAGAATAGA 1ЛСС ЙС TATG ХСЛС СЛЛЛЛЛЛЛАЛЛЛЛЛС С С С С С С С . ° 1100 °

СССССССССС10СА. - Э, 2. Штамм бактерий Escherichla cali BKM

CR 3170-продуцент фрагмента dRV7 — П для выявления ротавирусов человека, Таблица 1

Таблица 2

- PstI-PstI — фрагмент размером 2,671 т.п.н. векторной плазмиды р®б9;

- уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз: EcoRI., йпа1, Xmal, BamHI, Sal CI, AccI, HincI, HindIII; два сайта узнавания для эндонуклеазы рестрикции PstI; — три сайта узнавания для эндонуклеазы рестрикции HaeII; — ori репликации плазмиды рцс; — селективные маркеры Ap,hac хозяин - Escherichia coli 85.

1744111

5 - 666666ТТТТТТТТТТТТТ

66 СТТТТАЛЛО СОТСТС ЛОТС О СГОТТТОЛ О С СTTGCGGÒÑ ÒË 6ÑÑËÒ66ÑÒÎË6ÑÒËÎÑ, 100

ТТОСТТТТОТТЛТССТСЛТТТООЛОЛЛСОЛТЛОСТЛТАЛЛТТТЛТТССТТТТАЛСЛОТТТ

A G СЛЛ ТАЛАЛ ТОТЛ ТО ПОЛ CA G СТАЛА G ÒÎÎÀ ÒÀÀËËËË6À ÒÑËÀ GA TAAATTÒTA С АЛ . 200

ТТСТЛТТОТТТЛТ66ЛЛТТОСОССАССАСАЛСЛЛТ АЛЛЛАЛССТТЛТЛЛТАСТЛОТ6Л . ЗО0 а

ТЛЛТТС6ЛСАООЛЛТОАЛТТАТ6ААЛСОАТТАТ6ТТТААТЛА66Т66СТ6ТСТТЛЛТТТО

ТОЛЛОСЛСТТЛЛТТСАЛТСАЛЛОТСЛСАСАЛТСТОЛЛЛТТОСЛААТОТТСТТТСАЛОЛОТ . ч00

AG. СТОТ. Л6ЛСЛТ ТООЛАЛЛТТ ЛОТЛТТСЛОЛАЛЛОАААЛТСЛТСЛЛ6АС6ТЛСТ

ТТТТСЛТТССЛЛЛСЛЛСТЛСТС ТЛААЛТСТОТОТТЛЛТЛОСТЛТТОО" САЛТСЛЛЛЛОЛ, 500

Л ь.ТТОАЛЛСТАСТОСТЛСТОСССЛЛСОАООЛОЛЛЛТЛОТЛТТТСЛОАЛТО ЛОСТТТТАС

У A -:„--A-„-,ь- Л .—,Сь ТьУ ь —. ОССТЛТТ-т GA -.СЛОььТтт ь ь.ТАТ ь ь ЛТТЛС,ь Т ОАЛТО,ь ь СЛ ь ьЛСС.ь ЛТ; ТСЛОЛТ = Л. СТОТС ь.АЛО ОСТ г r.

i V.:.

ТОТТОС= ОЛЛТТЛЛОЛТОО=ЛОТЛСЛЛСЛОЛТТТОС=ОТЛЛТС ь. -ЛСЛТОО ЛЛЛООТСЛ

Ф

СТЛТАСЛОТТСТТЛЛЛТЛТТСЛТСЛВТГОСТЛЛССЛТОСЛОЛТЛОЛОТОТТТОСТЛСЛТЛ . еос

ТАЛОЛАТАЛТОСТАЛОАОТООТЛАТАТТЛСТОЛСТТСАЛТТТСТТЛОЛССАЛЛООАТТАТ

° 900

ТТООСЛАЛЛТТООТАСОСАТТСАСАТСТТСАЛТОИ ЛСАЛООТЛЛТАСААТТОАТАТАТ6

ТАЛОЛААСТОСТСТТТСААЛЛОЛ ТОААЛСЛЛОЛОЛЛЛЛЛС ССЛТТТЛАЛООЛТТСТСААС . 1000

ТОАСАОЛААААТООАТОАЛОТЛТСАСАТОТТООААТТТЛАТТСОСТТТСООТТСАААААТ

ОАТОЛТОАСОААОСАЛОЛЛТЛОЛТАОСОСТТЛТОТОЛССАЛАЛАЛЛЛААЛААСССССССС

CCCCCCCCCCTGCA-3

Фиг 2