Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая кор-антиген вируса гепатита в, лишенный днк 39с концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pre s @ / 1-55/, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент кор-антигена, вируса гепатита в, лишенного 39 с концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pre s @ /1-55/

 

(t9) (!! ) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК (5))5 С 12 N 15/51, 15/70, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4728573/13 (2.2) 10.08.89 (46) 23.02.92. Бюл. М 7 (71) Институт органического синтеза АН

ЛатвССР (72) Г. П; Борисова, И. Г. Берзинь, Э. Я. Грен, В. Я. Лосева, И. А, Петровский, П, П. Пумпен, П. M. Пушко, Ю. А. Озолс, В. П, Осе и В, B. Цибиногин (53) 575.224.2,577.2(088.8) (56) Борисова Г. П. и др. ДАН СССР, 1984; т.

279, с,.1245-1249, Борисова Г. П. и др. ДАН СССР, 1988, с.

298, с. 1474-1478. (54) PEКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯДНК

КОДИРУЮЩАЯ KOP-АНТИГЕН ВИРУСА

ГЕПАТИТА В, ЛИШЕННЫЙ ДНК 39С КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ С ЭКСПОНИРОBAHHbIM НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИ

ЭПИТОПОМ pre Sz(1-55), СПОСОБ E E КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERICHlA СО(! — ПРОДУЦЕНТ КОРАНТИГЕНА, ВИРУСА ГЕПАТИТА В, ЛИШЕННОГО 39С КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ

С ЭКСПОНИРОВАН.НЫМ НА ЕГО IlggEPXНОСТИ ЭПИТОПОМ pre Sz (1-55) (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, . генной и белковой инженерии, биотехнолоИзобретение относится к микробиологический и медицинской промышленйости, генной. и белковой инженерии, биотехнологии.

Цель изобретения — получение кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на поверхности чужеродным эпитопом, не обладающим сродством к нуклеиновым гии. Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его. поверхности чужеродным эпитопом, НЕ обладающим сродством к нуклеиновым кислотам, в данном случае получение в Е;соП химерных белковых структур с экспонированным на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, участком preSz HBV с 1 по 55 аминокислоту . Плазмида р GCS2-142 имеет размер 7071 п.о.. обеспечивает экспрессиюгена HBcAg- Л pre Я2 (1 —.55), кодирующего синтез рекомбинантных капсидных структур, обладающих антигенностью и иммуногенностью HBcAg и участка ргеЯ2 вируса гепатита В; плазмида не коньюгативна. Уникальные сайты рестрикции: BamHI, Sphl, Sall, NrnI, SnaI,АИ1И, Pstl, Sca1Xbal. Способ конструирования плазмиды pGCS 2 — 142 заключается во встраивании Mstll — Nlalll фрагмента плазмиды рНВ320 в плазмиду рНВс1315 по сайтам EcoRV u Clal после

144-аминокислоты гена НВсА9. Штамм Е. соИ ВКПМ В-4977-продуцент рекомбинант-: ных капсидных структур HBcAg Л -рге S2 (1 — 55), обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 13,2;4 суммарного клеточного белка, 3 табл. кислотам и, в конкретном случае, получение в E.coÈ химерных белковых структур с экспонированным на поверхности кор-антигена. лишенного 39 С-концевых аминокислот, участком рге Sz H BV с 1-й по 55-ю аминокислоту.

Сконструирован рекомбинантный ген

HBc Ag Л вЂ” pre $2 (1-55), кодирующий син1713930 теэ соответствующего белка, плаэмиды

pGCSz-142 для его экспрессии, а также штамм-продуцент Е,col! К802 (pGCS2-142) рекомбинантной капсидной структуры, обеспечивающий выход конечного продукта 5 в количестве не менее 13.27, суммарного белка Е.соИ.

Рекомбинантная плазмида pGCSz-142. состоит из следующих элементов: ДНК плаэмиды рНВс1315. которая представляет 10 собой вариант плаэмиды рНВс3, содержащей ген HBcAg с оптимизированным участков инициации трансляции, но с мутантным геном HBcAg, содержащим полилинкерную вставку по 144-й аминокислоте и преднаэ- 15 наченным для внедрения чужеродных последовательностей по этому участку, протяженность 6900 п.о., фрагмент генома

ÄHBV иэ плазмиды рНВ320 (7), соответствующий последовательности между сайтами 20 рестрикции МэтИ1794 и М!аИ!1626 и кодирующий участок рге52 (1--55) протяженностью

168 п.о. Размер плаэмиды 7050 п.о., мол.м, 4,5 МД.

В состав ДНК рекомбинантной плаэми- 25 ды р632-142 входят гены: ген НВс Ag Л—

pre Sz (1 — 55), обеспечивающий синтез конечного продукта; ген На. обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Ген HBcAg Ь вЂ” preSz (I-55) находится 30 под контролем тандема промоторов Р гр, Плазм@да pGCS2-142 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола. неконьюгативна.

Сущность способа конструирования 35 плазмиды pGCS2-142 состоит в том, что фрагмент гена pre Sz, именуемый НВЧрге Sz (1 — 551 протяженностью 168 п.о. внедряют по сайтам рестрикции EcoRV u С!а! в векторную плазмиду рНВ1315 с образованием ре- 40 комбинантного гена H BcAg Ь- pre Sz (1-55).

Штамм-продуцент HBcAg Л - pre $2 (1 — 55) получают трансформацией клеток

Е,соИ К802 рекомбинантной плазмидой

ДНК pGCSz-142. 45

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные..

Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины. 50

Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования

37 С, оптимум рН 7Я вЂ” 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота — минеральные соли. а 55 также органические соединения в аиде пептона, триптора. аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам: устойчив к ампициллину..то обусловлено наличием плаэмиды. Присутствие в штамме плаэмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК экси ресс-.методом.

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4977.

Пример 1. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК pGCS2-142.

10 мкг плазмиды рНВ1315, выделенной стандартным методом, расщепляют (частичНо) 3 ед. рестриктазы ECQRV в 25 мкл раство- . ра. содержащего 10 mM трис-НО, рН 7,5.; 50

mMNaCI. 10 mMMg Clz и 1 mM дитиотрейтол (ДТТ) в течение 30 мин при 37 С. Рестриктаэу анактивируют 15-минутным прогреванием при 650С. К 20 мкл реакционной смеси добавляют 6 мкл раствора Б, содержащего

70 mM трис-HCI, рН 8,0; 70 mM М9С!2 и 10

mM ДТТ, воду до конечного обьема 60 мкл и

15 ед. рестриктаэы Оа!. Инкубацию при

47 С проводят в течение 2 ч. После очистки на агарозном геле (на бумаге ДЕ-81) известным методом фрагмент ДНК с мол,м, 4,42

МД (размером 6900 п.о.) растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК.1), 50 мкг плазмиды рНВ 320, полученной очисткой на оксиапатите„расщепляют 25 ед, рестриктаэы Нра и 25 ед. рестриктазы

Есо8! И (Mst il) в 250 мкл раствора В, содержащего 10 mM трис-HCI, рГ 8,5; 10 mM

М9С!г и 1mM ДТТ в течение 3 ч при 37 С.

После очистки на агарозном геле на бумаге

ДЕ-81) известным методом фрагмент

Нра!816-МмИ1794 с мол,м. 0,62 Мд (размером 978 п,о.) растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК

2).

2 мкг ДНК 2 расщепляют 4 ед. рестриктаэы Hln !И (Nla III) в 20 мкл раствора Г. содержащего 10 mM трис-НС!, рН 8,5; 10 вМ

М9С!2 и 50 mM NaCI в течение 2 ч при 37 С.

Фрагмент МзтИ1794-Nlalll1626 размером

168 и o. rmcne очистки на 2 $-ном агарозном

rene (на бумаге ДЕ-81) растворяют в 10 мкл

Н2О (ДНК 3).

Выравнивание липких концов вектора и клонируемого фрагмента проводят совместно, для чего 0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНК 3 инкубируют с 4 ед. Т4 ДНК-полимеразы в 10 мкл раствора Д, содержащего 20 аМ трисHCl, pH 7,5; 10 mMMgClz, 1вМ ДТТ и 33 mM

dATP, бСТР, dTTP, dGTP в течение 30 мин при 37 С. Т4 ДНК-полимеразу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С.

После выравнивания липких концов эа-. шивку вектора и клонирующего фрагмента проводят в 12 мкл раствора Д с добавлением

10 ед. Т4 ДНК - лигазы и АТР до конечной концентрации 500 mM в течение 12 ч при

5 1713930 6 мкл клеток Е.coll RR1, обработанных 100 mM

СаС12 (конечная концентрация 5 10 кле9 ток/мл) для трансформации клеток по известному методу. 5

Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК, ожидаемой рестрикционной картой получает наименование рСС$2-142., 10

Штамм-продуцент Е,.соИ К802 (рОС$220

25 конечной концентрации 20 мг/мл и 10 mM соответственно и инкубируют 30 мин при

4 С. Лизат осветляют центрифугированием 30 собирают в осадке, полученном при 30% 35 насыщения . сульфатом .аммония. Осадок концентрации белка 25-50 мг/мл„и 6-7 мл этого- раствора наносят на колонку с Сефа-. 40 разведения клеточного лизата и титрируют против анти-НВс антител человека. B. качестве стандарта используют очйщенный 55

4 С. К реакционной смеси добавляют 100 выделенной экспресс-методом. Плазмида с

142). Выделение и очистка рекомбинантного белка НйсА9 Ь- рге $2 (1 — 55).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е.соП К802, рекомбинантной плазмидой pGCSz-142. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казаминовые кислоты 10; глюкоза 2, ампициллин

0,02. до оптической плотности ОП65о 4 — 5;

Клетки собирают центрифугированием и лизируют в трехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 М трис-HCI, рН 8,0, 0,15 М

NaCI, 0.1% тритон Х100. 0,005 М ЭДТА, 3 мгlмл лизоцима. После инкубации в течение 30 мин при 40С клетки подвергают трехкратному замораживанию — оттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и М9С12 до (10 000 g, 4 С, центрифуга). НВс Ag Л - pre

Sz (1-55) очищают следующим образом, Лизат подвергают фракционированию сульфатом аммония. НВс Ag Ь - рге $р (1- 55) растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0;

О, 15 M NaCI, 0,1 тритоне Х100до конечйой розой CI 48 (2,1 < 75 см), уравновешенную тем же буфером, но без тритона Х100. Фракции., проявляющие HBcAg-активность, собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50%-ным сульфатом аммония.

Определение .HBcAg-активности методом РИД.

Титр Н ВсАд определяют с помощью радиальной иМмуно-диффузии по Ухтерлони

Для этого готовят двукратные серийные

HBcAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл). Результаты титрования

HBcAg-активности методом РИД приведены в табл. 1. (синтез Н Вс Ag Л- рге $2 (1-55) 45

50 в бактериях Е.coll К802, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК pGCS2-142).

Определение pre $2-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка HBcAg

Л- pre Я (1 — 55).

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 -ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный. P-меркаптоэтанол и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водя; ной бане, Полученные лизаты (2 — 4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12-18%) размером 150х х150 х 0,75 мм. Электрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока: 7 MA. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу. Фильтры инкубируют с моноклональными:анти-рге Sz антителами мыши

МАЕ в разведении 1;500. на буфере TBS, содержащем 50 mM трис-,HCI. рН 7,8; 150.

mM Na CI 0,1% тритон Х100. 1% БСА, в течение 15 ч при 20 С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20ЯС с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мы.ши в разведении 1:200; Фильтры отмывают буфером ТВ$ (3 — 5 раз) и проявляют диаминобензидином. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специфических зон окраски, соответствующих белку с мол.м. 22,3 МД (или длиной 212 аминокислот). что соответствует схеме конструирования. Контрольные лизаты клеток Е.соИ К802 (рНВс3) таких зон не обнаруживают.

Электронномикроскопическая характеристика рекомбинантных капсидных структур Н Вс Ag Л - pre $2 (1-55), Препараты очищенного белка H8cAg

Ь - pre Я (1 — 55) готовят методом негативного контрастирования с применением 1%-ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе 1ЕМ 100 С при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз. Белок (1-55) образует капсиды диаметром 25 нм.

Определенйе pre $2-активности в составе капсидных структур НВс Ag Л - pre $2 (1-55) методом энзимоиммунологического анализа на твердой фазе.

В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. Очищенный белок НВс Ag Ь - рге Sz (1-55) разводят до концентрации 10 мкг/мл в 50 mM йаНСОзN82C03j рН 9,5 и вносят в лунки планшетов по 100 мкл в каждую. Инкубируют 16 ч при

37 С. после чего раствор удаляют из лунок, 1713930

10

Ь -pre Sz (1-55) 25 pGCSz-142, кодирующая кор-антиген вируса .гепатита В, лишенный ДНК 39 С-концевых верхности эпитопом pre. Sz (1-55) размером

7071 п.о. и мол.мас. 4,53 МД, содержащая

30 плазмидную ДНК рНВс 1315 размером 6900 п,o.; Mstll1794 — Ntall 11626, фрагмент плазмидной ДНК рНВ 320, кодирующий последовательность участка pre Sz вируса гепатита В, размером 17 п.о.,; уникальные;

35 сайты рестрикции и их координаты;

ВатН1(О), sphl (191), Sall(276), Nrul(599).

$паl(1871) Aft(2098), РзО(3236), $са1(3471), Xlal(5176); гены, регуляторные участки, генетические маркеры: ген HBcAg Л - рге Sz

40 (1-55), обеспечивающий синтез рекомбинантных капсидных структур;.HBcAg . Лрге Sz (1-55), координаты 5087 — 5740; тандем промоторов Ро р; ген Sla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину

45 (координаты 2918-3778)..

55 планшеты высушивают. В лунки вносят моноклональные анти-рге Sz антитела мыши

MAE в разведении 1:5000 на буфере ТВ.

После инкубации в течение 2 ч.при 37ОС планшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой и вносят по 100 мкл. конъюгата пероксидазы хрена с белком S.aureus в раз: ведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию. 8 лунки вносят по 100 мкл 0,25,(,-ного раствора ортофенилендиамина 2НС! в 0,1 M цитрате натрия; рН 5,0, 0,027 HzOz, инкубируют 30 мин при

20ОС, реакцию останавливают добавлением

100 мкл 0,1 N НСI; Появление коричневой 1 окраски свидетельствует о наличии pre $2активности. Для количественной оценки активности измеряют оптическую плотность ,при 492 нм и определяк3т величину Р/N (табл, 2).

Отсутствие реакции в отрицательном контроле (HBcAg) свидетельствует о специфичности связывания анти-pre Sz антител рекомбинантными капсидными структурами HBc Ag Ь- рге Sz (1 — 55), Иммунологическая активность рекомбинантных антител приведена в табл. 2.

Иммуноэлектронная микроскопия капсидных структур с использованием коллоидного золота, Капсиды НВсАд Ь - pre $2 (1-55) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин, Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,057;-ный Твин 20 (РВ$ — Твин 20) и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 -ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл PBS—

Твин 20; инкубируют 15 мин в 0.03 мл раствора моноклональных анти-pre Sz антител мыши МАЕ в разведении 1:10, промывают

0,5 мл PBS — Твин 20, инкубируют 20 мин в

0,03 мл антител (кролика) против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1:5); промывают 0,5 мл PBS — Твин 20. Сеточку помещают на:1 ч в 0,03 мл раствора pA-AU, содержащего белок А, который коньюгирован с частицами коллоидного эблота диаметром 8 — 10 нм, промывают.0,5 мл PBS -

Твин 20 и затем 1 мл Hz0. Капсиды окрашивают методом негативного контрастирования 0,15 мл 2 Д-.ного уранилацетата. Все операции выполняются при 20 С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов кэпсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота.

В качестве отрицательного контроля использованы капсиды HBcAg, не несущие эпитом pre Sz (1-55).:Эти.капсиды не образуют комплексов с коллоидным золотом, Иммуногенная активность рекомбинантных капсид HBcAg.Ü- pre Sz-(1-55).

Для определения иммуногенности рекомбинантными капсидами HBcAg Л. - рге

Sz (1 — 55) иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в

1 мл физиологического раствора PBS, с.1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена повторяют на 14й и 21-й день и с 28-го дня начинают брать кровь. Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов: НВсАО(для определения антиНBс антител (fr-pre $), белок-оболочки PHK-фага fr, несущий весь участок pre S — для определения анти-рге $2,антител. Титры антител на

28-й день иммунизации приведены в табл. 3 (иммуногенность химерных капсид HBcAg

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК аминокислот с экспонирбванным на его по2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSz-142, заключающийся в том, что й1а111 1626 — .

МмИ1794, фрагмент длиной 168 п.о.. кодирующий участок pre $ (1 55), выделяют из плаэмиды рН В 320 п.о., заполняют и удаляют липкие концы с помощью ДНК полимераэы,. встраивают в вектор для .экспрессии рНВс1315 по сайтам EcoRV u Clat в положении 144 аминокислоты гена HBcAg так. что за 144 аминокислотой образуется вставка

pre Sz (1 55). что вызывает терминацию трансляции, исключающую 39 С-концевых

1713930

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Составитель С.Бандрин

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Демчик

Редактор Н,Яцола

Заказ 661 Тираж,, Подписное ., ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 аминокислот гена HBcAg, трансформируют рекомбинантными ДНК штаммы бактерий

Escherichia coll, отбирают с помощью контактирования и выделяют из этих клонов целевую плазмиду, 3. Штамм бактерий Escherlchla coll

ВКПМ 8-4977 продуцент кор-антигена, вируса гепатита В, лишенного 39С аминокислот с экспонированным на его поверхности

5 эпитопом рге Sz (1-55),