Способ определения токсичности водной среды

 

Применение: определение токсичности водной среды. Сущность: культуру клеток соединительной ткани животных, находящихся в стационарной фазе роста, инкубируют в течение 1,5 - 2,5 ч в опытных и контрольных средах на субстрате. Критерием токсичности считают снижение количества клеток в опыте по сравнению с контролем. 5 табл. с/

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (я)5 -G 01 N 33/18

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I (21) 4855334/13 (22) 26.07,90 (46) 15,07,92, Бюл,№26 (71) Научно-производственное обьединение

"Тайфун" и Научно-исследовательский институт медици,чской радиологии (72) М,M.Àíòîùèíà, Т,И.Иванова. В.И.Рябченко, Н,И.Рябченко, М,В.Трофимова, В.Ю.LUBMBTQB M Л.С.Эршестова (531 586 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1234770, кл. G 01 N 33/18, 1986, Авторское с видетельство СССР

¹ 866470, кл. G 01 N ЗЗ/18, 1981, Гудзенко Т.B. Биотестирование качества воды с использованием культуры клеток рыб. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 1989, 26 с, Изобретение относится к методам биологического тести рования качества воды и может быть использовано в промышленности, сельском хозяйстве, а также при режимном и санитарном контроле качества воды.

Известен способ определения токсичности и мутагенности воды с использованием дафн ий, в котором учитывается инициирование во втором поколении морфологических летальных и сублетальных мутаций, определяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, по уменыыению плодовитости и продолжительности жизни. Длительность эксперимента состав:ляет 16 — 22 дня и более. Этот метод трудоемок и не может быть использован в экспресс-контроле природных вод.

В способе о токсичности испытуемой жидкости судят по изменению способности клеток подвижной земной водоросли

Г

4. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНОЙ СРЕДЫ (57) Применение: определение токсичности водной среды, Сущность; культуру клеток соединительной ткани животных, находящихся в стационарной фазе роста, инкубируют в течение 1,5 — 2,5 ч в опытных и контрольных средах на субстрате, Критерием токсичности считают снижение количества клеток в опыте по сравнению с контролем. 5 табл, Dunallella salina возвращать первоначальную эллипсоидную форму в дистиллированной воде после обработки токсикантом. . Сравнение контрольных образцов, где восстановление исходной формы происходит за 12 — 15 мин, и опытных, где восстановления не происходит, позволяет сделать вывод о токсичности среды. Способ достаточно прост технически, однако трудоемок, так как на обработку одной пробы уходит 40 мин и более.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения токсичности растворов загрязняющих веществ и сточных вод с использованием в качестве биотеста культуры клеток рыб, основанный на исследовании адгезивной способности клеток к поверхности субстрата в стационарной фазе роста монослоя клеток фолликулярного эпителия (гонад бычка-кругляка) или оспен1748060 ных раэростков на коже карпа под действи-, ем растворов загрязняющих веществ и сточных вод.

Согласно прототипу предварительно клетки культивируют во флаконах со средой

199 с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина в течение 2 — 5 сут в зависимости от вида линии клеток до образования монослоя на дне флакона. Затем ростовую среду удаляют и вносят растворы исследуемых веществ, приготовленные на среде 199 с добавлением антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина) для предотвращения бактериального загрязнения. Экспонируют флаконы при оптимальной для жизнедеятельности клеток температуре

24 — 96 ч. Результат оценивают визуально по цитотоксическому эффекту, проявляющемуся в откреплении части клеток монослоя от дна флакона. Определяют сохранность монослоя культуры клеток, подсчитывая число оставшихся на субстрате клеток с помощью камеры Горяева, и выражают его в относительных единицах, по величине доли которых судят о токсичности исследуемого раствора.

Кедбстатками способа-прототипа являются низкая чувствительность (оп ределяется низкой чувствительностью тест-объекта и мешающим влиянием среды 199 с антибиотиками, в которой происходит взаимодействие тест-объекта с исследуемым веществом), что затрудняет биотестирование природных вод, а также низкая производительность (так как время проведения эксперимента 24 — 96 ч), что лишает способ экспрессности.

Целью изобретения является повышение точности и снижение времени определения.

Для достижения цели в способе определения токсичности водной среды, предусматривающем внесение биологического тест-обьекта — культуры клеток животного происхождения, находящихся в стационарной фазе роста, в опытные и контрольные среды на субстрат, последующую инкубацию их, определение количества клеток в опытных и контрольных средах на субстрате и определение токсичности опытной среды в случае снижения количества клеток в ней па сравнению с контрольной, в качестве тест-объекта используют культуру клеток соединительной ткани животных, инкубацию тест-объекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а период инкубации равен 1,5 — 2,5 ч, 10

Игла, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого ската и 10 ЕД/мл пенициллина (для предупреждения бактериального загрязне15 ния), После того, как на дне флакона Карреля сформировался монослай клеток соедини40

Работа по предлагаемому способу осуществляется следующим образом.

Тестирование выполняют, например, на перевиваемой культуре фибробластов китайского хомячка линии Ч-79, или субклона анеуплоидных клеток штамма 237 линии

Bildii FAF 28, подкожной соединительной ткани,или фибробластоподобных клеток лимфомы мыши линии (=929

Сначала выращивают клетки в специальных флаконах Карреля. в ростовой среде тельной ткани в стационарной фазе роста, ростовую среду из флакона удаляют и заливают исследуемую нативную воду, доведенную по осмотическим параметрам до физиологического раствора, для чего предварительно к 9,65 мл воды добавляют 0,36 мл 0,4 М раствора хлорида натрия. Для контроля в другой флакон с монослоем тех же клеток на дне заливают физиологический раствор, приготовленный на дистиллированной воде растворением 0,35 мл 0,4 M раствора хлорида натрия в 9,65 мл дистиллята.

Наличие контроля необходимо для оценки состояния культуры клеток и возможности использования ее в качестве тестобъекта, а также для сравнения поведения монослоя клеток в условиях стандартного физиологического раствора и в условиях исследуемых природных вод, осмотические свойства которых доведены до параметров физиологического раствора, Флаконы с исследуемыми и контрольными пробами помещают в термастат.

Йз таблицы видно, что экспозиция проб от 1,5 до 2,5 ч наиболее оптимальна. В исследуемых пробах под действием токсичных веществ происходит атрофия части клеток, ведущая к изменению функции их прикрепления и распластывания на твердом субстрате. В результате происходит округление части клеток и переход их в раствор. По завершении двухчасовой инкубации ðàñтвор из.флаконов переносят в пробирки и при помощи камеры Горяева определяют количество Х1 открепившихся клеток в каждой из них.

Оставшийся на дне флакона монослой заливают 10 мл трипсина. Флакон встряхивают и переносят взвесь клеток в пробирку.

Подсчет оставшихся на стекле клеток Х2, перешедших в раствор трипсина, ведут по той же методике, 1748060

Находят общее количество клеток, участвовавших в биотестировании;

Х=Х1+Х2

Вычисляют процент А оставшихся на стекле клеток. х2 100

Х где А — процент оставшихся на стекле клеток;

Х2 — оставшиеся на стекле клетки;

Х вЂ” общее количество клеток в монослое, Найденная величина характеризует адгезивную способность клеток монослоя к поверхности стекла, Резул ьтаты оп ыта сра вн и в а ют с контрольными пробами, где адгезивная способность клеток к субстрату после двухчасовой экспозиции монослоя в физиологическом растворе не изменяется; а доля оставшихся на стекле клеток составляет 100 .

Высокая чувствительность тест-объекта (соединительной ткани) позволяет выделить

: уровни токсичности исследуемых растворов, которые определяют по степени ответа тест-объекта на воздействие исследуемой среды. Оценочная шкала приведена ниже.

Результаты трех параллельных опытов по данному способу с использованием в качестве тест-объекта культур клеток соединительной ткани: фибробластов китайского хомячка линии V-79, клона 237 и клеток лимфомы мыши линии :929 представлены в табл.3.

Для эксперимента брали пробы воды с известным уровнем токсических веществ (пирокатехина и паробензохинона).

Приведенные в табл.3 данные по определению токсичности природных вод показывают, что доля оставшихся на субстрате клеток(; ) и соответственно уровеньтоксичности коррелирует с количеством токсических веществ, определенных методом химического анализа. Корреляция между уровнем токсичности образцов природных вод и концентраций токсических веществ, как показано в табл.2, зарегистрирована для всех трех типов клеток соединительной . ткани. Монослой всех трех типов клеток реагирует одинаково на наличие токсиканта в определенной концентрации, В табл.4 представлены результаты биотестирования воды на токсичность, полученные предлагаемым способом и по способу-прототипу.

Исследуемые пробы воды имели известный уровень токсических веществ (пирокатехина — опыт 1 и парабензохинона — опыт

2). В опытах, выполненных способом-прототипом, в качестве тест-обьекта использовали культуру яйцеклеток бычка кругляка (ЯБК), время экспозиции монослоя с исследуемыми образцами воды 72 ч. Разведение природной воды готовили на среде 199 в соотношении 1:10 — 1 мл исследуемой >кидкости:10 мл среды 199.

В опытах предлагаемым способом в качестве тест-объекта использовали монослой

10 культуры фибробластов китайского хомячка линии V-79. Разведение природной воды готовили на стандартном физиологическом растворе. При этом сначала доводили осмотические показатели природной воды до по15

55 казателей физиологического раствора. Для этого к 9,65 мл природной воды добавляли

0,35 мл 0,4 М р-ра хлорида натрия. Затем 1 мл приготовленного раствора тестируемой воды растворяли в 10 мл стандартного физиологического раствора. Время экспозиции тест-объекта в исследуемой воде 2 ч.

В качестве контроля использовали физиологический раствор. Учет результатов проводили описанным способом. долю оставшихся на стекле клеток выражали в %.

Как следует из данных табл,4, с увеличением концентрации токсических веществ падает доля оставшихся на стекле клеток.

Предлагаемый способ более чувствителен, так как он дает возможность улавливать незначительные концентрации токсических веществ в исследуемых жидкостях, Так, в опыте 1, выполненном по прототипу, зарегистрирована высокая токсичность (46 оставшихся на стекле клеток), а предлагаемым способом — очень высокая (11 оставшихся на стекле клеток); в опыте 2 — средняя (66 оставшихся на стекле клеток) и очень высокая (12;ь оставшихся на стенке клеток) соответственно.

В табл.5 представлены результаты определения токсичности природной воды предлагаемым способом и контрольного определения токсичности воды с использованием в качестве тест-обьекта рачка дафния магна, Дафнии используются в кратковременных (2 — 4 сут) опытах для установления острой токсичности сточных вод и отдельных веществ по длительности выживания рачков, Контролем служит выживаемость рачков в чистой воде.

В каждый опытный стакан наливают200 мл исследуемой жидкости. Из кристаллизатора пипеткой отбирают 10 экземпляров дафний в возрасте 2 — 4 сут и переносят в исследуемый раствор. В первые 8 ч ежечасно, а затем один -два раза в деньучитывают количество живых особей, степень и характер их передвижения, количество сброшен1748060

Таблица

Зависимость адгезивной способности клеток к поверхности субстрата (стекла) оТ времени экспозиции (контрол

Таблица 2

Оценочная шкала токсичности растворов в зависимости от доли оставшихся на суб страте клеток монослоя соединительной ткани после воздействия растворов разного качества (в %1»

Токсичность

i На токоична

Слабая токсичность

Средняя токсичность

Высокая токсичность Счень вь сокая токсичность ных панцирей. Погибших дафний удаля от пипеткой, Раствор раз в сутки обновляют ввиду продолжения биохимического окисления и детоксикации. По результатам опытов определяют среднее время выживания 5

50;4 особей, Изменения жизнедеятельности дафний в опытах сравнивают с контролем, Если 50% дафний гибнут за 24 — 48 ч, считают, что среда обладает очень сильной токсичностью, если за 4 сут, то среда харак- 10 теризуется как сильно токсичная. Если за период наблюдений гибели дафний не происходитт, то исследуемая жидкость острой токсичностью не обладает, Таким образом, результаты контрольно- 15 го биотестирования природной воды на рачках дафния магна поцтверждают вывод Об уровне токсичности исследуемых образцов нативной воцы с использованием в качестве тест-обьекта монослоя культур клеток ки- 20 тайского хомячка.

Предлагаемый способ более чувствителен и обладает зкспрессностью по сравнению со способом-прототипом (чувствительность выше в 2 — 4 раза, а вре- 25 мя, необходимое для проведения эксперимента, в предлагаемом способе в 36 раз меньше, чем по прототипу). Таким образом, изобретение обеспечивает по сравнению с прототипом более точный и быстрый биоконтроль качества природных вод, Формула изобретения

Способ определения токсичности водной среды, предусматривающий внесение биологического тест-обьекта — культуры клеток животного происхождения, находящихся в стационарной фазе роста, в опытные и контрольные среды на субстрат, последующу о инкубацию их, определение количества клеток в опытных и контрольных средах на субстрате и определение токсичности опытной среды в случае снижения количества клеток в ней по сравнению с контрольной, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и снижения времени определения, в качестве тест-объекта используют культуру клеток соединительной ткани животных, инкубацию тест-обьекта в опыте проводят в среде с концентрацией хлорида натрия, равной физиологической, а период инкубации выбирают в пределах от l,5äo 2,5 ч.

1748060

Таблица 3 клон 237

Концентрация токсиканта линия V-79

1- 929

Токсикант

Токсичность

Токсичность

Доля оставшихся на стекле клеток, Доля оставшихся на стекле клеток, о

Токсичность

Пирокатехин н

6 10

4,5 10

61

Средняя

Высокая

Средняя

Высокая

66

Средняя

Высокая

13 10

Очень высокая

Не токсична

Очень высокая

Не токсична

Парабензохинон

Контроль

Очень высокая

Не

ТОКСИЧнд

100

100

100

0,00

Таблица 4

П е лагаемый способ

П ототип

Токсикант

Концентрация токсиканта

Опыт

N токсич- тест- . ность обьект тестобъект токсичность ект

45 10

КХV-79

ЯБК

Высокая

13 10

ЯБК

12

КХV-79

КХV-79

ЯБК

100

100

0,00

Таблица 5

Дафния магна

Культура клеток Китайского хомячка

Тест-объект

Среднее время выживания 50 % особей за 96

Ч ЛТ50

% гибели рачков за 96

Оценка токСИЧНОСТИ

Оценка токСИЧ НОСТИ

Адгезия, %

96

Не токсична

Высокая токсичность.

Очень высокая токсичНОСТЬ

Не токсична

70

Не токсична

Сильная ток СИЧНОСТЬ

Весьма сильная токсичность

Не токсична

100

100

Конт оль

Пирокатехин

Парабензохинон

Контроль

Доля оставшихся на стекле клеток, о время выдер-. живания в токсиканте час доля оставшихся на стекле клеток, о

Средняя

Не токсичHB время выдерживания в токсиканте час доля оставшихся на стекле клеток, о о

Очень высокая

Очень высокая

Не токсична