Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения биологически активных веществ в лабораторных и промышленных условиях. Цель изобретения - ускорение способа и снижение содержания солей в целевом продукте. Способ состоит в дефибринировании и гемолизе крови теленка с последующим отделением веществ с мол.мае. выше 8000 Дальтон путем непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации, концентрированием ультрафильтрата и частичным отделением солей электродиализом с помощью пакета ячеек из попеременно расположенных катионои анионообменных мембран с проницаемостью мембраны вплоть до мол.м. 300 Дальтон при плотности тока 5-70 мА/см свободного поперечного сечения мембраны, постоянного напряжения 0,2-2 В на мембрану и температуре 0- 30°С. Полученное соединение обладает свойством стимулировать клеточное дыхание и обладает ранозаживляющим действием . 3 табл. со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю А 61 К 35/14, 31/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 (21) 3595639/14 (22) 20,05.83 (31) Р 3219348,1 (32) 21.05.82 (33) ОЕ (46) 15.07.92. Бюл, N 26 (71) 3олько Базель АГ (СН) (72) Удо Виттенбергер (СН) (53) 612,015 (088.8) (56) Патент ФРГ N. 1076888, кл. 30 h 2/04, 1956. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, СТИМУЛИРУЮЩИХ КЛЕТОЧНОЕ ДЪ|ХАНИЕ (57) Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения биологически активных веществ в лабораторных и промышленных условиях. Цель изобретения — ускорение спп оба и сниже-Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения физиологически активных веществ в лабораторных и промышленных условиях.

Цель изобретения — ускорение способа и. снижение содержания солей в целевом продукте, Способ осуществляется следующим образом.

Телячью кровь подвергают дефибринированию путем интенсивного перемешивания, затем фильтрацией отделяют фибрин.

После дефибринирования и объединения порций крови в нее можно добавить консервант, затем кровь сразу замораживают и в замороженном виде хранят до последующей переработки, Дефибринированную кровь подвергают химическому или механиЯЛ 1748637 А3 ние содержания солей в целевом продукте, Способ состоит в дефибринировании и гемолизе крови теленка с последующим отделением веществ с мол.мас. выше 8000

Дальтон путем непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации, концентрированием ультрафильтрата и частичным отделением солей электродиализом с помощью пакета ячеек из попеременно расположенных катиона- и анионообменных мембран с проницаемостью мембраны вплоть до мол.м, 300 Дальтон при плотности тока 5 — 70 мА/см свободного поперечного г сечения мембраны, постоянного напряжения 0,2-2 В на мембрану и температуре 030 С. Полученное соединение обладает свойством стимулировать клеточное дыхание и обладает ранозаживляющим действием, 3 табл.

3 ческому гемолизу. Полученный гемолизат подвергают непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации с использованием Ф мембран, пропускающих соединения с 00 мол.мас. не более 8000 Дальтон, Предпоч- О тительно применять мембраны из триаце- (Д татцеллюлозы или гидрофильного полиолефина.

В результате ультрафильтрации получают продукт с мол.мас, не превышающим

8000, Остающуюся после переработки в . Ы процессе ультрафильтрации кровь отбрасывают. Полученный ультрафильтрат, не содержащий белков и высокомолекулярных соединений, концентрируют при пониженном давлении и температуре не выше 40 С до плотности (при 20ОС) f,10 — 1,15 г/мл. При. этом удаляется органический растворитель

1748637 (использованный при гемолизе и консервировании крови) и консервант. Получают раствор с концентрацией сухого вещества

180--230 мг/мл, Этот раствор для частичного удаления содержащихся в нем неорганических солей и получения раствора с молярностью 250-550 мосмоль, электропроводностью 40 — 75 mS/ñì или плотностью (при 20 С} 1,05 — 1,08 г/мл подвергают электродиализу. Для электродиалиэа используют блок из чередующихся кэтионо- и анионообменных мембран, пропускающих соединения с мол.мас, не более 400, Процесс проводят при плотности тока 5-70 мА/см

2 свободного сечения мембраны, постоянном напряжении 0,2 — 2 В на мембрану и температуре Π— 30 С.

- Полученный водный раствор, содержащий стимулирующие клеточное дыхание вещества, можно использовать непосредственно, разбавить или концентрировать, Эти вещества можно применять для ускорения процессов заживления, Пример 1. Ультрафильтрация, Используют четырехступенчэтую ультрафильтрационную установку типа В 1 фирмы Paterson Candy 1птеrnational Ltd. В каждой из 4-х ступеней (1-4) установки имеется по 2 ультрафильтрэционных трубчатых модуля с фильтрующей поверхностью каждого модуля 1,7 м, Мембраны модулей выполнены иэ ацетилцеллюлозы и пропускают соединения с мол.мас, не более 8000. В качестве напорных насосов используют ротационные насосы с производительностью около 1000 л/г при давлении 10 бэр. Для подвода и отвода продуктов используют дозирующие насосы Р5 — Рт, соответственно

Рз — Рю, производительность которых можно менять в пределах 2 — 20 л/г.

Имеются 4 емкости Tt-Та обьемом

300 л, Температура растворов с помощью питаемых охлаждающей водой холодильников Kt — Ка поддерживается равной 18 С, В емкости Т1-Тз заливают по 250 л дефибриллированной и гемолизировэнной телячьей крови, содер>кэщий 15 об.% консерванта (2 мас.%: объем спиртовой рас,твор смеси метилового и пропилового эфиров 4-оксибензойной кислоты, взятых в весовом соотношении 9:1). Затем пускают нэсосы Р1 — Рз, в результате чего вытекает ультрэфильтрэт UF, и когда содержимое емкостей Т1-Тз уменьшэется ро 150 л, запускают питающие насось Рз-P7 и отводящие насосы Рв-Р1р. Насосом Р5 со скоростью 10 л/ч подается дефибринировэнная и гемолизированная кровь, содержащая консервант, Одновременно с помощью насосов Рб и Р7 в емкости Т2 и Тз в качестве разбэвителя подается со скоростью 10 л/ч раствор консервирующей добавки KL, содержэщий 85 об,% воды и 15 об,%: 1% (мэс.:объем) спиртового раствора смеси метилового и пропилового эфиров 4-оксибензойной кислоты, взятых в весовом соотношении 9;1. Производительность насосов Рв-P tp регулируется таким образом, чтобы объем жидкостей в емкостях Т вЂ” - Tа оставался постоянным, равным 150 л, При этом в емкости Тг и Тз подают такое количество разбэвителя К, которое компенсировало бы количество вытекэющего ультрэфильтрэтэ UT.

Кэк только в емкости Та нэбирэется 120 л

15 раствора, поступающего со ступени 3, включают подающий насос Ра. Вытекающую из емкости Та через переливной пэтрубок отработанную кровь отбрасывают, Через 36 ч во всех четырех ступенях

20 устанавливается равновесие. Ультрэфильтрэт собирают для концентрирования, Количество ультрэфильтрата, вытекающего на

1-й ступени 4,7 л/ч, нэ 2-й ступени 11 л/ч, нэ

3-й ступени 10,4 л/ч, нэ 4-й ступени 1,8 л/ч.

25 Производительность насоса Ра составляет

5,3 л/ч. Р9 4,3 л/ч, Рте 3,9 л/ч, э количество отработэнной крови АВ, вытекающей из емкости Ра 2,1 л/ч, Концентрирование. Ультрэфильтрэт

30 подвергают дистилляции при давлении

30 мбэр и 35 С, при этом отгоняется содержащийся в растворе консервэнта спирт и большая часть консервирующего средства выпадает в осаддк и отфильтровывается. К

35 фильтрэту добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 5, в результате чего остаток консервирующего средства выпадает в осадок, который отделяют фильтровани. ем, Полученный продукт с плотностью (при

40 20 С) 1,13 мг/мл используют нэ последующей стадии электродиализэ (исходный концентрат N. 733,10). Из другой порции крови получен концентрат N. 350,03, Электродиализ, Исходные кОнцентраты

45 деляг нэ порции, подвергаемые затем электродиэлизу, Из концентрата 733.10 получают электродиэлизэты М 12 и 13, из концентрата N 350.03 — электродиэлизаты

N 14-19.

50 Процесс проводят в установке для электродиэлизэ ВЕ1 2 фирмы Berghog GmbH в основную часть установлен блоК, состоящий из 7 пэр энионообменной (а) и кэтионообменной (к) мембран (тип CM I/ и AM), С каж55 дой стороны блока дополнительно имеется по одной мембране (к).

Используют мембраны, пропускающие соединения с мол,мас, не выше 400, К мембранному блоку подсоединены 3 циркуляционных контура, Из емкости Т1 с помощью

1748637 насоса Р> через холодильник К подается подвергаемый обессоленный раствор 0(дилюат), Из емкости Тг с помощью насоса Pz через холодильник Kz подается водный раствор К, в который переходят соли, Из емко- 5 сти Тз с помощью насоса Рз подается 2 Д (мас.объем) водный раствор сульфата .натрия Е, предназначенный для промывки электродов. В холодильниках К и Kz отводится тепло: температура растворов под- 10 держивается 25 С.

На линии циркуляционного контура дилюата Д после холодильника К смонтирована измерительная ячейка для определения электропроводности LF. Количество 15 поступающего после концентрирования ультрафильтрата UK регулируется с по-. мощью двухпозиционного регулятора R.

Со стороны концентрата из емкости Тг непрерывно отводится часть образующего- 20 ся более концентрированного раствора солей КА, взамен которого с помощью насоса Р5 подается соответствующее количество дистиллированной воды W, Кроме того, в мембранном блоке имеет место пе- 25 ренос некоторого количества воды со стороны дилюата в направлении образования концентрата, Часть дил юата Д после измерения электропроводности в измерительной ячейке 2F 30 непрерывно отводят и после пропускания через стерилизующий фильтр SF в качестве готового продукта P хранят до последую. щей переработки в фармацевтические препараты в емкости Т4 при 0 С, 35

Для запуска установки для электродиализа в 2-литровую емкость Т> заливают 1,2 л полученного концентрированного ультра/ фильтрата UK. В емкость Тг такого же объема заливают 1 л дистиллированной воды, а 40 в однолитровую емкость Т 750 мл 2 /-ного раствора NazOa, Запускают насосы Р -Рз, подающие растворы со скоростью 90 л/ч. К электродным пластинам (+ и — ) прикладывают постоянное напряжение такой величины, 45 чтобы через свободное сечение мембраны протекал ток плотностью 20 мА/см, При сечении мембраны 37 см общий ток равен г

750 мА. Начальное напряжение 1б В в течение часа снижают до стационарной величины 5,5 В (для блока, состоящего из 5 пар мембран). Через 10 ч электропроводимость раствора снижается до величины 45-50

mS/cM. С помощью дозирующего насоса

Ра, управляемого регулятором Р, устанавливается такой расход поступающего концентрированного ультрафильтрата, чтобы электропроводность дилюата оставалась в пределах 45 — 50;

Производительность дозирующего насоса Pg устанавливают равной 200 мл/ч, Количество выходящего из емкости Tz концентрата соли КА составляет 220 мл/ч, Процесс диализа повторяют несколько раз. В результате осуществления способа получают электродиализаты N 12 — 19, условия получения и свойства которых представлены в табл. 1 и 2; Дополнительные данные для диализатов, полученных из других порций крови, представлены в табл. 3 и 4, Предлагаемый способ позволяет ускорить получение биологически активного вещества и снизить содержание в нем солей, Формула изобретения

Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание, путем дефибринирования телячьей крови и отфильтровывания образующегося при этом фибрина, гемолиза полученного раствора, отделения содержащихся в нем веществ с мол,м, выше 8000 Дальтон мембранным способом разделения и частичного отделения содержащихся в полученном растворе неорганических солей, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения качества целевого продукта за счет снижения содержания в нем солей, отделение веществ с мол,м, выше 8000 Дальтон осуществляют путем непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации, а частичное отделение неорганических солей — путем электродиализа с помощью пакета ячеек из чередующихся катионо- и энионообменйых мембран с проницаемостью мембраны до мол.мас. 300 Дальтон при плотности тока

5-70 мА!см свободного поперечного сечег ния мембраны, напряжении 0,2 — 2 В на мембрану и температуре 0-30 С.

1748637

Таблица 1

Исходный концентрат

М. 733.10

Электродиализат

Показатель 10*"*

Активность по Варбургу

+14*+*

% снижения про- должительности

13,7*+*

9,9*

10,9***

Плотность тока, мА/см

Температура, С

Постоянное напряжение в асчете на о н мемб ан, 50

50, 25

0,7

1,0

* Bce значения выше 1,0 являются положительными; количественное разграничение не представляется возможным, ** Измеренные значения относятся к ультрафильтрату, разбавленному стерилизованной водой в 5 раз, *** Измеренные величины относятся к электродиалиэату, разбавленному стерилизованной водой в 5. раз.

Содержание сухого вещества, мг/мл

Плотность, 20 С, г/мл

Электропроводность, mS/ñì

Осмолярность, мосмоль

ЗольHocTb, % от сухого

Общее содержание азота вещества

Азот аминогрупп

Хлорид

Натрий

Калий

Глюкоза

Мочевина

Общий фосфор

Лактат

Уксусная кислота

Фибробластная активность стимулирование роста по отношению к стандартной культуре*

% по отношению к стандарту

Время, необходимое для заживления ран по сравнению с действйем физиологического раствора поваренной соли

212,1

1,129

149

1053**

66,25

2,55

0,65

35,88

27,19

4,34

10,91, 2,15

0,78

9,72

1,83

1,66+*

103,0

1,057

404**

33,90

4,83

1,23

15,74

17,30

1,59

22,30

3,59

1,52

17,58

3,45

1,5*** 108,7

1,060

497**

41,80

4,57

1,25

19,31

19,49

2,14

20,52

3,43

1,39

17,71

3,18

1,5***

1748637

Таблица 2

Исходный концентрат

N 305.03

Эпектродиализат

Показатель

М 14 и 15 N 16 N 17

Н 1 8 N 1 9

Э

109,7

1,060

56

414

101,28

1,052

46

355

129,62

1,073

40 (6 С)

510"

107,58 111,37

1,058 1,060

55 56

410""." 428

106,37

1,057

378

213,11

l,129

1052

36,11 36,72

43,90

28,10. 34,55 32,48

75,57

6,16

1,64

5,59

i,38

12,28

18,03

7,30

17,30

Хпорид

Натрий

Калий

Глюкоза

Ночевина

1,20

8,65

4,76 — ив

Общий фосфор

1,75

20,62

4,48

Лактат

1,3

07" 18" 2 О"

+30 +9 +30

1 1+ФФ 1 2«%%

7 У

2,0" »

+5" " +6

9,0"""

15,7

25

20

22

1,3

0,8

0,4

1,2

1,0

Таблица 3

Содержание сухого вещества, м г/мл

Плотность (20 С), г/мл

Электропроводность, mS/ñì

Осмолярность, мосмоль

Зольность,Ф от сухого ве" щества

Общее еодержание азота, Ф от сухого вещества

Азот аминогрупп - <—

Уксусная кислота — цФибробластная активность

Стимулирование роста по отношению к стандартной культуре!

Активность по Варбургу, 3 по отношению к стандарту

Время, необходимое для заживления ран по сравнению с действием физиологического раствора поваренной соли, Ф снижения продолжительности о

Температура, С

Плотность тока, мА/смз

Постоянное напряжение в расчете на одну мембрану,В

2,73 а;64

37,17

24,79

3,78

3,87

2,43

0,77

9,78

2,37

6,26

1,56

9,20

16,99

1,07

9,81

5,39

1,91

22,72

4,58

5,61

1,46

11,89

18,23

t,10

9,06 .

4,56

1,75 ,21,29

4,56

5,87

1,45

12,69

18,36

1,12

9,09

5,11

1,67

21,63

4,62

5,13

1,28

l6,30

20,40

1,53

7,95

4;34

1,56

18,32

4,01

0,92

1 0,28

5,04

1,94

22,60

4,68

1748637

Таблица 4

Составитель Н,Гуляева

Техред М,Моргентал . Корректор Э.Лончакова

Редактор А.Долинич

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2514 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1130ЫЬ, Москва, Ж-З5, Раушская наб„4/5