Способ отбора веществ, обладающих гепатотропным действием

 

Использование: для отбора веществ, обладающих гепатотропным действием. Сущность изобретения после введения вещества животным под наркозом осуществляют перфузию печени под давлением, деформирующим поверхность, затем берут образцы печени, обрабатывают их для заливки в эпон, делают полутонкие срезы окрашивают их и проводят морфометрию структур, сформированных поверхностью гепатоцитов под давлением, при этом в качестве структур выявляют впячивания поверхности внутрь клеток, устанавливают отношение площади сечения впячиваний к их количеству и в случае его изменения относительно контроля определяют наличие гепатотропного действия у вещества Способ прост в исполнении

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

51708;4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4877157/14 (22) 23.10,80 (46) 30.07.92. Бюл. ¹ 28 (71) Днепропетровский медицинский институт (72) Л.А.Палиенко, В,Ф.Ушаков, Н,П.Гриша, К.И.Лившиц и С.Д,Крамарь (56) Ушаков В.Ф, и др, Влияние гепатотропных промышленных веществ на контактные взаимодействия гепатоцитов крыс, — Гигиена труда и профзаболеваний, 1984, № 5, с. 20-22. (54) СПОСОБ ОТБОРА ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАК)ЩИХ ГЕПАТОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Использование: для отбора веществ, обладающих гепатотропным действием, СущИзобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к токсикологии, и может быть использовано для ускоренного гигиенического нормирования веществ в средах.

Известны морфологические способы определения результатов действия неблагоприят)(ых факторов окружающей среды на клетки печени животных, Однако известные способы не обладают высокой чувствительностью, а следовательно, точностью, поскольку позволяют выявлять результаты либо длительного действия гепатотропных веществ, либо краткосрочного действия веществ в концентрациях, намного превышающих пороговые, т.е. таких, которые вызывают значительные структурные изменения ядра и цитоплаэмы клеток, что ограничивает их использование при гиность изобретения: после введения вещества животным под наркозом осуществляют перфузию печени под давлением, деформирующим поверхность, затем берут образцы печени, обрабатывают их для заливки в эпон, делают полутонкие срезы, окрашивают их и проводят морфометрию структур, сформированных поверхностью гепатоцитов под давлением, при этом в качестве структур выявляют впячивания поверхности внутрь клеток, устанавливают отношение площади сечения впячиваний к их количеству и в случае его изменения относительно контроля определяют наличие гепатотропного действия у вещества. Способ прост в исполнении, гиеническом нормировании веществ в средах.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения влияния гепа- у тотропных веществ на контактные —.Ф взаимодействия гепатоцитов, заключающийся в следующем. После воздействия ве- 0 ществ проводят перфузию органа под 4 давлением, деформирующим поверхность, 0" клеток, Затем берут образцы печени, обрабатывают их для заливки в эпон и изготавливают ультратонкие срезы, которые исследуют на просвечивающем электронном микроскопе, На срезах выявляют нарушения в клетках путем морфометрии структур, сформированных поверхностью гепатоцитов, — межклекточных контактов.

Получают параметры элементов ультраструктуры контактов и в случае их измене1751676 ния определяют влияние гепэтотропных веществ.

Известный способ обладает высокой чувствительностью, а слеДовательно, точностью, поскольку позволяет выявлять результаты краткосрочного действия гепатотропных «веществ в концентрациях, близких к Ъбрб овым, т.е. таких; которые вызывают мйнимальные изменения в клетках, в.данном случае нарушения поверхности гепатоцитов, без повреждения ядра и цитоплазмы. Однако выявление ультра структуры контактов гепатоцитов предусматривает использование сложной техники приготовления ультратонких срезов, для исследования которых необходимо применение дорогостоящей и не всегда доступной просвечивающей электронной микроскопии, в результате чего известный способ не может широко использоваться в практике гигиенического нормирования, Целью изобретения является упрощение способа путем выявления нарушений на светооптическом уровне.

Цель достигается тем, что в способе определения влияния гепатотропных веществ, включающем выявление нарушений в клетках по результату морфометрии структур, сформированных поверхностью гепатоцйтов, на препаратах, приготовленных из образцов печени, взятых после перфузии органа под давлением, деформирующим поверхность клеток, и обработанных для заливки в эпон, в качестве структур на полутонких срезах берут впячивания поверхности внутрь клеток, устанавливают отношение площади сечения впячиваний к их количеству и в.случае его изменения определяют гепатотропное действие веществ.

Способ осуществляют следующим об-. разом.

Экспериментальным материалом служили 24 белые беспородные крысы-самцы массой 180-200 г каждая. 12 опытных животных подвергали однократной ингаляционной затравке в герметичных камерах в течение 4 ч стиролом (СТ) в концентрации

1100 мг/мз (6 крыс) и трихлорэтиленом (ТЭ) в концентрации 2500 мг/м (6 крыс). В проведенных ранее исследованиях по определению влияния этих веществ на контактные взаимодействия гепатоцитов было установлено, что СТ и Т3 в вышеназванных концентрациях. изменяют параметры ультраструктуры контактов гепатоцитов, но не вызывают повреждения ядра и цитоплазмы, характерные для деструктивных клеточных форм. 12 контрольных животных были помещены в такие же камеры, в которые поступал атмосферный воздух. Через

18 ч пос. е экспозиции всех коыс поочеоедно наркотировали 10 -ным тиопенталом натрия, который вводили внутрибрюшинно по.

0,5 мл каждому животному. Затем животным вскрывали брюшную полость, через портальную вену в кровеносное русло печени нагйетали раствор Хенкса при Т=+37 С под давлением 45 мм рт,ст., вызывающим деформацию поверхности, но не разрушающим клетки. Отток жидкости блокировали

10 наложением лигатур на нижнюю полую вену (выше и ниже печеночной вены). Через 1 — 1.5 мин после начала перфузии меняли раствор

Хенкса на глютаровый альдегид и фиксировали ткани печени в течение 2 — 3 мин. Затем вычленяли одну долю печени и вырезали кусочки размером 1 см, которые обрэбатыз вали по общепринятой методике для заливки в эпон, После заливки на микротоме

1 мкм). Срезы наклеивали на предметные стекла и окрашивали метиленовым синим — азур-П-фуксином. Покрашенные срезы высушивали и исследовали нэ световом микроскопе, Проводили морфометрию впячиваний поверхности внутрь клеток наложением планиметрической сетки, имеющей

100 точек; при увеличении х 10 х 90 на 20 полях зрения у каждого животного. Опреде30 ляли площадь сечения впячиваний (число тест-точек, приходящихся на впячивэния) и количество впячиваний на площади среза, ограниченной 100 точками сетки), Затем брали отношение площади сечения впячиваний к их количеству.

Результаты морфометрии препаратов печени у отдельно взятых животных (примеры конкретного выполнения способа) сведены в табл, 1.

Результаты морфометрии препаратов печени по группам животных, обработанные методом вариационной статистики, сведены в табл. 2, Из представленных в табл. 1 и 2 результатов видно, что стирол и трихлорэтилен обладают гепэтотропным эффектом и в концентзоэциях соответственно 1100 и 2500 мг/м вызывают в первом случае увеличение, а во втором — уменьшение отношения площади сечения впячиваний деформированной поверхности гепатоцитов внутрь клеток к количеству впячивэний в единице площади полутонкого среза.

55

Таким образом, по предлагаемому показателю можно определить действие вещества на клетки печени в концентрациях, не вызывающих повреждения ядра и цитоплэзмы, но изменяющих параметры структур, 20 изготавливали полутонкие срезы (толщиной

1751676 сформированных поверхностью гепатоцитов.

Использование изобретения упрощает способ отбора веществ, обладающих гепатотропным действием (появляется возмож- 5 ность его реализации на светооптическом уровне). Кроме того, сокращается время исследования препаратов печени, на основании которого определяют гепатотропное действие веществ, за счет приготовления 10 полутонких, а не ультратонких срезов ткани, а также за счет применения значительно меньшей по объему морфометрии, что важно для реализации способа при ускоренном гигиеническом. нормировании. Предлагае- 15 мый способ позволяет излучать механизм действия гепатотропных веществ на клеточную поверхность и устанавливать границу между регрессивными изменениями и компенсаторно-приспособительной перестрой- 20 кой клеток печени.

Формула изобретения

Способ отбора веществ, обладающих гепатотропным действием, путем введения их в организм, проведения перфузии печени под давлением, деформирующим поверхность клеток, забора образцов и обработки их для заливки в зпон, подготовки срезов, их микроскопии с последующим проведением морфометрического исследования структур, сформированных поверхностью гепатоцитов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа путем выявления нарушений на светооптическом уровне, готовят полутонкие срезы, затем проводят их световую микроскопию и морфометрию впячиваний поверхности внутрь клетки, исследуют площадь их сечения, рассчитывают ее отношение к общему количеству впячиваний и при его изменении относительно контроля определяют наличие гепатотропного действия веществ, Т а б л и ц а 1.

Показатели морфометрии у отдельно взятых животных после. экспозиции

КоличестХарактеристика животных

Попе зрения

N препарата по протоколу

Отношение плошади сечения впячиваний к количеству впячиваний

Пло!цадь Вплчивв ний (число тйст точек, приходящихся на вплчивания) во впячи ваний

679

Контроль

8 среднем на препарат

После воздействия 659

СТ в концентрации

1100 мгlнз

22

16

20 -5

16

27

39

27

24

16

23

1 г

4

6

8

11

12

13

14

16

17

18

19

2 >

21

24

23

22

13 . 15

18

14

12

19

13

23

22

19

23

28 гц

32

34

1Ý

24

38

16

2l

38

19

31

22

437

26

-43

44

0,75

0,62

1,32

1,00

0,61

0,88

0,81

0,71

0,47

0,74

0,39

0,86

0,29

0,6г

0152

0,73

0,53

0,62

0,55

0,37

0,67

1,59

2, .4

1,35

1,25

0,96

1,60

1,44

1,30 1,33

175!676

Прс>дол»>ение табл . 1.!

5 6

> ред>4(>м на >1р пар

1,31

Контроль

120

2

4

1,18

В среднем на препарат

В среднеи н препарат

0,628

После воздействия ТЭ 112 в концентрации

2500 мг>>мз

10 ! l

1?

13

14

16

17

18

19

7

9

11

l2 !

14 !

16

17

18

l9

20 I

3

5

7

9

11

12

13

14

16

1/

18

19

7 I

7 II

31

17

26

29

26 > 9

16

7.1

28

26

33

23

19

24

26

28

3!

17

17

14

34

26

22

12

8 !

12

22

14

21

l4 !

14

11

18

12

l0 !

21

19

22

25 2?

21

19

26

13

16

17

13

21

;г

24

17

32

26 !

22 !

22

27

22

24

11

37

26

23

16

31

18

24

18

32

29

16

21

34

23

1,26

1,09

1,24 о,77

1,24

0>97

1,37

1,50

1,23

1,00

1,31

1,65

7,00

1,10

0,71

0>72

0,75 ! >

1,41

2,00 о,81

1,08

2,14

0,89

0,68

0,77

0,78

1,55

0,96

1,00

1,56

0,50

0.73

0,49

0,46

0,61

0,94

0,88

0,68

0,56

0,63

0,78

0,44

0,48

0,69

0,86

0,35

0,63

0,43

0,8о

0,62

1751676

Таблица 2

Результаты морфометрии по группам животных после действия гепатотропных веществ

Корректор Н.Филь

Редактор А.Долинич Техред M.Ìoðãåíòàë

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул, Гагарина, 101

Заказ 2688 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5