Способ определения биологической активности культуры микроорганизмов

 

Применение: определение биологической активности культуры микроорганизмов , их метаболических взаимодействий, Сущность: после выращивания испытуемой культуры на агаризованной среде с нее снимают слой с выросшей испытуемой культурой и подсевают набор тест-культур. Параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризованную среду. Биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах. 3 ил., 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 0 1/02, 1/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4778161/13 (22) 05,01,90 (46) 07.08.92. Бюл. М 29 (71) Институт биофизики СО АН СССР (72) Л,С,Тирранен и Г.Т.Титова (56) Егоров Н.С, Основы учения об антибиотиках, M„1979, с. 158-159. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАН ИЗ МО В

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для определения метаболических взаимодействий микроорганизмов.

Известен метод агаровых блочков, согласно которому антагонистическую активность испытуемых культур определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культуры вокруг агаровых блочков, на поверхности которых находятся испытуемые культуры.

Однако при поточной работе с большим количеством испытуемых культур и тесткультур метод агаровых блочков требует больших затрат рабочего времени. а.также обладает недостаточно высокой точностью определения биологической активности культур.

Целью изобретения является сокращение времени и повышение точности определения биологической активности микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем чТо " перед посевом тест-культур со среды снима- ют слой с выросшей испытуемой культурой, параллельно тест-культуры засевают на чистую эгаризованную среду, после инкубиро„„. Ж „„1 752771 Al (57) Применение: определение биологической активности культуры микроорганизмов, их метаболических взаимодействий, Сущность: после выращивания испытуемой культуры на агаризованной среде с нее снимают слой с выросшей испытуемой культурой и подсевают набор тест-культур.

Параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризованную среду. Биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах. 3 ил., 2 табл. в ания измеряют диаметры выросших колоний, а биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах.

На фиг, 1 изображен репликатор; на Я фиг, 2 -схема чашки Петри, заполненной слоем агаровой питательной среды, на которой расположена агаровая пластинка, засеяннаяя испытуемой культурой (а) и на которой репликатором нанесены тест-культуры, по- (Л сле удаления из чашки агаровой пластинки с испытуемой культурой (б), вид сбоку; на фиг. 3 — колонии тест-культур, выросшие в опыте и контроле, по соотношению диаметров которых судят о биологической активности испытуемой культуры.

Сущность метода агаровых пластинок с использованием репликатора заключается в том, что испытуемую культуру засевают на агаровую пластинку, помещенную в чашку

Петри на поверхность твердой питательной среды. По истечении срока выращивания испытуемой культуры агаровую пластинку удаляют из чашки и на нижний слой твердой среды наносят с помощью репликатора од1752771 новременно до 23 тест-культур (число тесткультур определяется числом лунок в станине репликатора). Параллельно тест-культуры засевают на чистую агаризо ванную среду и после инкубирования измеряют диаметры выросших колоний.

Биологическую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах, Пример, Биологическую активность четырех испытуемых культур Mycobacterium

mucosum BKM 462, Bacillus cereus ВКМ 504.

Pseudomonas melochlora BKM 877, Candlda

rnycoderma BКМ у-933 изучали методом агаровых пластинок с использованием репликатора, В качестве тест-культур использовали Streptococcus faecalis ВКМ 6, M yco b acte rium t acti colum В КМ 355, Mecobacterium mucosum ВКМ 462, Bacillus

cereus BKM 504, Pseudornonas gracilis BKM

551, Pseudomonas melochlora ВКМ 877, Azotobacter chroococcvm ВKM 888, Опыты проводили в 5-кратной повторности. Питательной средой служит пептонный агар (1% пептона, 0,5% NaCi, 2% агара). Для приготовления агаровых пластинок в стеклянное кольцо диаметром 60 мм, находящееся в стерильной чашке Петри, пипеткой наливали теплую агаризованную среду толщиной 2 мм. После того как среда застывала, стерильным пинцетом удаляли кольцо из чашки. Агаровую пластинку переносили в центр доугой чашки, заранее заполненной 35 мл пептонного агара. Таким образом готовили чашки для всех испытуемых культур с учетом 5-кратной повторности и контрольные чашки, т,е. 25 чашек. Затем из 2-суточной испытуемой культуры по оптическому стандарту мутности на 10 ед. готовили суспензии, Испытуемые культуры (0,05 мл) высевали "газоном" на поверхность агаровых пластинок, Контрольные чашки не засевали испытуемыми культурами. Чашки инкубировали в термостате при температуре 28"С в течение 2 сут, после чего специальной лопаткой агаровые пластинки с испытуемыми культурами удаляли из чашек, В результате получили 20 чашек со стерильной агаризованной средой, содержащей продукты жизнедеятельности четырех испытуемых культур, и 5 контрольных чашек, со стерильной средой без продуктов жизнедеятельности испытуемых культур, В каждую чашку на поверхность среды

penfIMKaTopoM наносили одновременно все тест-культуры. Для этого из 2- суточных тест-культур готовили суспензии по стандарту мутности на 10 ед., которыми заполняли лунки станины репликатора. Погружая штырьки репликатора в лунки, переносили суспензии тест-культур на поверхность агаровой среды. Через 3 сут роста тест-организмов метров опытных и контрольных колоний в процентах приведено в табл. 1. Типы действия обозначены "ч+" — положительное действие, "-" — отрицательное действие .0— нейтральноре действие, Действие испытуе10 мой культуры считали положительным или отрицательным в зависимости от того, больше или меньше диаметр колоний в опыте по сравнению с контролем, Для удобства результаты экспериментов переводили в бальную систему (табл. 2) следующим образом. При разнице в диаметрах контрольной и опытной колоний 0-19% действие оценивали как нейтральное, при разни15 це колоний 20-39% действие оценивали в + 1 балл, при разнице 40 — 59 — в + 2 балла, при разнице от 60-79% — в +. 3 балла, при разнице свыше 80% — в + 4 балла, Таким образом, из 28 рассмотренных в эксперименте случаев методом агаровых

25 пластинок с использованием репликатора выявлено 10 нейтральных, 1 положительное и 17 отрицательных действий. в том числе 8 бактерицидных (-4 балла). Для сравнения этот же эксперимент был проведен методом агаровых блочков по стандартной методике

В результате из 28 изученных методом блочков действий 7 оказались отрицательными и

21 нейтральными, Во всех случаях, когда методом агаровых блочков установлено отрицательное действие испытуемой культуры на рост тест-культуры, методом агаровых пластинок также выявлено отрицательное

35 действие со 100%-ным ингибированием ро40 ста тест-культур, т,е. бактерицидное. Еще в

10 случаях, когда методом агаровых пластинок зарегистрированы отрицательные дейст-. вия, главным образом бактериостатические, методом блочков не было обнаружено какойлибо биологической активности у испытуемых культур. Также метод агаровых блочков не позволяет выявить положительные действия культур, тогда как метод агаровых пластинок не только позволяет выявить такие

50 действия, но и измерить их силу. Таким образом, анализ сравнения результатов экспериментов показал, что метод агаровых пластинок с использованием репликатора позволяет выявлять более широкий спектр биологической активности испытуемых культур, чем метод агаровых блочков.

Предлагаемый метод является экспресс-методом. Позволяет в одной чашке

Петри изучить в 3 раза больше микробных

55 в термостате измеряли диаметры опытных и контрольных колоний тест-микробов.

5 Соотношение средних значений диа1752771

Таблица1

Та блица 2 действий, чем метод блочков, в связи с чем более экономичен по времени, питательным средам, стерильной посуде.

Формула изобретения

Способ определения биологической активности культуры микроорганизмов, предусматривающий инкубирование испытуемой культуры на агаризованной среде с последующим подсевом набора тест-культур, повторное инкубирование посевов и определение биологической активности испытуемой культуры по степени роста тесткультур, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени и повышения точности определения, перед посевом тест5 культур со среды снимают слой с выросшей испытуемой культурой, параллельно тесткультуры засевают на чистую агаризованную среду, после-инкубирования измеряют диаметры выросших колоний, а биологиче10 скую активность определяют по соотношению диаметров колоний тест-культур на опытной и контрольной средах.

1752771

Фкг. 2

Фиг. 3

Составитель О,Корженко

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор О. Юрковецкая

Редактор В.Петраш

Заказ 2734 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101