Способ анализа митохондриальной днк растений

 

Использование: генетико-селекционные исследования, молекулярная генетика. Сущность изобретения: очищенный препарат митохондрий, выделенных из этиолированных проростков, лизируют с помощью додецилсульфата натрия в электрофоретической ячейке блока агарозного геля в течение 1 ч при напряжении 1 В/см, после чего проводят электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4842724/13 (22) 28.06,90 (46) 07.09.92. Бюл, N 33 (71) Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО АН СССР (72) Ю.М,Константинов, Т,Ю.Нестерова и

Е.Л.Таусон (56) R.J.Kemble et al. Genetics, ч,95, р.451—

458, 1980. (54) СПОСОБ АНАЛИЗА МИТОХОНДРИАЛЪНОЙ ДНК РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к генетико-селекционным исследованиям, а также исследованиям по молекулярной генетике, молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в работах по определению типа растительной цитоплазмы, имеющих важное значение при генетическом анализе материала, полученного путем обычной и соматической гибридизации и методами химического мутагенеза, генетической и клеточной инженерии. Предлагаемое изобретение может быть использовано также при подборе родительских пар для получения гибридных семян сельскохозяйственных культур, имеющих пищевую и кормовую ценность, Известен способ анализа митохондриальной ДН К растений, включающий выделение митохондрий из семидневных этиолированных проростков растений, лизис органелл и фракционирование митохондриальной ДНК путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Полученная ул ьтрацентрифугированием А „ 1759334 А1 (57) Использование: генетико-селекционные исследования, молекулярная генетика, Сущность изобретения; очищенный препарат митохондрий, выделенных из этиолированных проростков, лизируют с помощью додецилсульфата натрия в электрофоретической ячейке блока агарозного геля в течение 1 ч при напряжении 1 В/см, после чего проводят электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. 1 з.п. ф-лы, 4 ил. митохондриальная ДНК после освобождения от бромистого этидия, депротеинизации хлороформом, диализа подвергается анализу методом электрофореза.

Недостатком этого способа является наличие трудоемких и длительных стадий, при проведении которых возможна потеря отдельных фракций мтДНК или их денатурация. Способ может быть осуществлен в целом за 14 суток, Кроме того, способ не позволяет осуществлять массовый анализ митохондриальной ДН К.

Известен способ анализа митохондриальной ДНК растений, основанный на получении очищенных от примесей митохондрий, их лизисе с последующей очисткой ДНК путем ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия, депротеинизации хлороформом, диализа. Полученный препарат ДНК анализируют посредством электрофореза в геле агарозы. Способ при своем проведении занимает в среднем 6 суток. Недостатком такого способа является существование трудоемких и длительных стадий, при осуществлении которых воз1759334

35

55 можна потеря отдельных фракций митохондриальной ДНК (например, плазмидоподобных ДНК) или их денатурация. Другим недостатком является невозможность проведения одновременного массового анализа ДНК митохондрий разных растительных генотипов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ анализа митохондриальной ДНК, включающий получение очищенных от примесей митохондрий, их лизис с последующей очисткой ДНК путем трехкратной фенол-хлороформной экстракции и осаждения этанолом. Полученный препарат ДНК анализируют методом злектрофореза в геле агарозы, Проведение данного способа занимает, в среднем, 6 суток. Недостатком способа является то, что при реализации данного способа возможны потеря отдельных фракций митохондриальной ДНК (наи ример, плазмидоп сдобн ых ДН К) или их денатурация. Кроме того, способ не позволяет одновременно проводить массовый анализ ДНК митохондрий разных генотипов растений.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение массовости анализов митохондриальной ДНК в генетика-селекционных исследованиях. Способ основан на лизисе изолированных растительных митохондрий с помощью детергента в геле агарозы, Оптимальные условия лизиса в геле агарозы создаются благодаря использованию анионного детергента додецилсульфата натрия. Электрофоретический анализ в геле агарозы полученного таким способом препарата митохондриальной ДНК позволяет индентифицировать тип цитоплазмы (фертильный или стерильный), выявить конкретный тип стерильности (T-, S- или С- в случае кукурузы), определить видоспецифический набор митохондриальной ДНК разных размерных классов (необходимо при анализе типа цитоплазмы у потомства при межвидовых скрещиваниях или при анализе цитоплазмы у аллоплазматических форм растений). Предлагаемый способ позволяет сократить время проведения процедуры анализа в среднем в 1,5 — 2 раза. Одновременно создается возможность проведения массовых анализов митохондриальной ДНК у нескольких генотипов.

Известные способы анализа митохондриальной ДНК растений основаны на использовании полностью очищенного и репарата ДН К митохондрий и требуют и роведения трудоемких и длительных стадий ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия с зтидийбромидом и фенолхлороформной экстракции. При анализе

ДНК митохондрий вышеуказанными способами невозможно упростить процедуру анализа и предотвратить возможную потерю отдельных размерных классов ДНК органелл (например, плазмидоподобных ДНК).

При этом отсутствует возможность одновременного анализа ДНК митохондрий нескольких генотипов, что является необходимым условием сравнительного анализа в генетико-селекционных исследованиях. В отличие от этого анализ митохондриальной ДНК растений в предлагаемом техническом решении проводится путемлизирования митохондрий в геле агароэы с помощью детергента и электрофореза освобождаемых нуклеиновых кислот, что значительно упрощает процедуру и ускоряет (по меньшей мере, в 1,5-2 раза) время.ее проведения. Одновременно создается возможность массового проведения анализа митохондриальной ДНК у нескольких генотипов сразу (максимальное число анализируемых ге нотипов-12).

Предложенный способ отличается от прототипа использованием процедуры лизиса митохондрий с помощью анионного детергента непосредственно в ячейке блока агарозного геля.

Пример 1, Семена гибридов кукурузы

Жеребковский-86МВ и Краснпцарский362ТВ проращиваются в термостате при

27 C в темнотена влажной фильтровальной бумаге. Колеонтили трехдневных этиолированных проростков этих гибридов в количестве 5 г срезаются и используются для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования, Для этого срезанные побеги кукурузы помещают в предварительно охлажденный стакан гомо40 генизатора, заливаются ледяной средой выделения (соотношение навески побегов и среды 1:4) и быстро измельчаются ножницами. Растительная ткань с помощью пресса продавливается через небольшие отверстия

45 в поршне гомогенизатора (диаметр отверстий 0,5 мм). Среда выделения содержит сахарозу (0,3 М), КНгРО4 (0,018 М, рН 7,2), ЭДТА (0,005 M), KCI (0,010 М), МцС!г (0,001

M), меркаптоэтанол (0,010 М).

Гомогенат фильтруется через капроновую ткань и центрифугируется при 2000g в течение 3 мин. Осадок отбрасывается, надосадочная жидкость центрифугируется 3 мин при 2000g. Полученный осадок митохондрий тщательно промывается в 4 мл среды выделения, из состава которой исключен меркаптоэтанол (среда промывания). Время промывания составляет 3 мин. Среда промывания содержит дополнительно бычий

1759334 сывороточный альбумин (10 мг/мл), Промытые митохондрии осаждаются центрифугированием при 20009 s течение 3 мин.

Митохондриальный осадок ресуспендируется в 0,3 мл буфера, содержащего 0,030 М трис-HCI (рН 8,0), 0,005 МЭДТА,,0,1 М NaCI, 20 -ную сахарозу. Ячейки вертикального блока 0,8 агарозного геля (размер геля

110х90х2 мм) наполняются лизирующим буфером, содержащим 2 -ный додецилсульфат натрия, 5 -ную сахарозу, 0,05 -ный бромфеноловый синий в трис-боратном буфере (рН 8,3) по 20 мкл в каждую ячейку, Состав трис-боратного буфера; трис (0,089

M), борная кислота (0,089 М), ЭДТА (0,0025

М), Под лизирующий буфер наслаивается по

10 мкл суспензии митохондрий. Электрофорез в стандартном приборе с платиновыми электродами проводится в трис-борзтном буфере в течение 1 ч при напряжении 1

В/см, затем втечение 2,5 ч при напряжении

5 B/ñì. Гель окрашивается в растворе бромистого этидия в воде (0,5 мкг/мл) и фотографируется в ультрафиолетовом свете. На электрофореграмме (фиг,1) выявляется ДН К митохондрий из 0,3 г проростков кукурузы.

Анализ на электрофореграмме фракций митохондриальной ДНК, принадлежащих гибридам Жеребковский-86МВ и

Краснодарский-362ТВ, показывает, что первый гибрид получен на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) молдавского типа (S-тип цитоплазмы), а второй гибрид на основе ЦМС техасского типа (Т-тип цитоплазмы). Для S-типа цитоплазмы, как показано в прототипе, характерно наличие двух линейных плазмидоподобных

ДНК S1 и S2 размером, соответственно, 6,397 т.п.н., 5,452 т,п,н„которые обнаруживаются на электрофореграмме (фиг,1,Б).

Для цитоплазмы Т-типа характерно присутствие другого набора плазмидоподобных

ДНК (ппДНК); линейной ДНК размером 2,1 т,п,н. и кольцевой 1,95т,п.н., которые также отчетливо видны на фотографии (фиг.1,А).

Таким образом, данный способ позволяет проводить анализ митохондриальной ДНК конкретного генотипа и установить на основе какого типа ЦМС был получен исследуемый гибрид.

Пример 2; Семена гибрида кукурузы

Краснодарский-303ТВ проращиваются в термостате при 27 С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3 — 4дневных этиолированных проростков гибрида в количестве 10 г срезаются и используются для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Процедура выделения митохондрий и дальнейшие этапы анализа мтДНК

55 аналогичны описанным в примере 1, В отдельном варианте при внесении митохондриальной суспензии в ячейку геля добавляли проназу из расчета 5 мгlмл, Результаты электрофоретического анализа мтДНК гибрида кукурузы Краснодарский303ТВ приведены на фиг.2 (1 — контроль; 2 — обработка и рон азой; 3 — контроль). Из данных фиг.2 следует, что способ позволяет определить присутствие высокомолекулярной мтДНК и фракций плазмидоподобной

ДНК (ппДНК). Обработка проназой приводила к увеличению электрофоретической подвижности фракции ппДНК, что позволяет предполагать существование подвижных комплексов вида ДНК с белками. В варианте с обработкой проназой отмечено лучшее проявление полос ппДНК на электрофореграмме. Соответствие полос на электрофореграмме фракциям ДHK u PHK установлено путем обработки наносимого препарата ДНКазой и РНКазой, соответственно (данные не приводятся). Воэможность включения в процедуру анализа мтдНК ферментативных обработок (ДНКазой, РНКазой, проназой) является дополнительным преимуществом предлагаемого метода.

Пример 3. Семена кукурузы гибридов

Жеребковский-86МВ и Краснодарский362ТВ проращиваются в термостате при

27 С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-дневных этиолированных проростков гибридов в количестве

10 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1, Лизис изолированных органелл и электрофоретический анализ мтДНК гибридов проводится в блоке горизонтального агарозного геля. Результаты анализа мтДНК гибридов Жеребковский-86М (А) и Краснодарский-362ТВ (Б) представлены на фиг.3 (B — HInd II — фрагменты ДНК фага Я., используемые в качестве электрофоретических маркеров). Из данных фиг.3 следует, что препарат мтДНК гибрида Жеребковский86МВ в отличие от Краснодарского

362ТВ, содержит линейные S1 и S2 ппДНК размером 6,4 и 5,4 тысяч пар нуклеотидов соответственно.

Пример 4. Семена кукурузы линии

Oh56A и гибридов 155хС103и 9хС103 проращиваются в термостате при 27 С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-дневныхэтиолированных проростков линии и гибридов в количестве 20 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1. Осадок изолированных митохондрий ресуспендируется в 500 мкл буфера, содержащего

1759334

0,030 М и трис-HCI (рН 8,0), 0,005 ЭДТА, 0,1

М NaCI, 20о -ную сахарозу. Результаты электрофоретического анализа мтДНК линии Oh 56А и гибридов W155xC103 и

WF9xC103 в блоке вертикального агарозного геля представлены на фиг,4. Можно видеть, что отдельные фракции мтДНК линии и гибридов выявляются в виде четких хорошо разрешающихся на электрофореграмме и Ол ОС.

Пример 5. Семена кукурузы линии

Oh56A и гибридов W155 х С103 и WF 9 х С103 проращиваются в термостате при 27"С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-дневных этиолированных проростков линии и гибридов в количестве

20 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1.

Осадок изолированных митохондрий ресуспендируется в 500 мкл буфера, содержащего 0,030 М трис-HCI (рН 8,0), 0,005 M ЭДТА, 0,1 М NaCI, 0,1 М NaCI, 20 -ную сахарозу.

При нанесении препарата для анализа используют разные количества митохондриальной суспензии: 5,10,20 мкл суспензии органелл. Результаты анализа мтДНКлинии и гибридов приведены на фиг.4 (А,Б,B — 10, 20 и 5 мкл митохондриальной суспензии соответственно). Можно видеть, что наиболее оптимальным объемом митохондриальной суспензии (при ресуспендировании митохондрий, полученных из 20 г проростков, в

500 мкл) для анализа фракций мтДНК методом лизиса органелл в ячейке вертикального агарозного геля является 5 мкл. При этом наблюдаются наиболее четко разрешающиеся голосы ДНК.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ анализа митохондриальной ДНК растений, основанный на лизисе митохондрий с помощью анионного детергента додецилсульфата натрия в ячейке вертикального или горизонтального агарозного геля и разделения освобождающихся нуклеиновых кислот с помощью электрофореза, выгодно отличается От ранее известных способов анализа митохондриальной ДНК вышеописанных аналогов и прототипа. При этом удается избежать использования дорогостоящих импортных реактивов и импортного оборудования (ультрацентрифуги, пробирки), а также денатурации и потерь анализируемых фракций митохондриальных ДНК.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в следующем; высокая нативность препарата митохондриальной ДНК анализируемого генотипа, достигаемая за счет быстроты реализации предлагаемого способа; сокращение времени проведения процедуры анализа в среднем в 1,5 — 2 раза; отсутствие дорогостоящих процедур очистки митохондриальной ДНК (ультрацентрифугирование в градиенте хлористого цезия с этидийбромидом, хроматография на сефарозных гелях с использованием импортного оборудования и реактивов); воэможность проведения массовых анализов митохондриальной ДН К у нескольких генотипов (максимальное возможное число анализируемых генотипов-12); возможность введения в процедуру анализа митохондриальной ДНК ферментативных обработок.

Электрофоретический анализ в геле агарозы полученного предлагаемым способом препарата ДНК митохондрий позволяет установить следующее: в случае потомства межвидовых скрещиваний, полученного методом соматической гибридизации, определить по видоспецифическому набору митохондриальных ДНК разных размерных классов, какому из родителей принадлежит цитоплазма; идентифицировать тип цитоплазмы растения (фертильный или стерильный); в случае стерильных растений установить конкретный тип цитоплазматической мужской стерильности (например

"Молдавский", "Техасский" или С-тип для кукурузы).

Формула изобретения

1, Способ анализа митохондриальной

ДНК растений, включающий выделение митохондрий из этиолированных проростков растений, лизис митохондрий в присутствии детергента и буферна с последующий фракционированием митохондриальной ДНК методом электрофореза в агарозном геле, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности анализа, лизис митохондрий проводят в электрофоретической ячейке во время префореза, при этом в качестве детергента используют додецилсульфат натрия, а в качестве буфера— раствор, содержащий трис в концентрации

0,089 моль, борную кислоту в концентрации

0,089 М и ЭДТА в концентрации 0,0025 М, 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиэис митохондрий проводят в течение 60 мин при нап яжении 1 В/см, 1759334

Б А В пп ит Я

Составитель Е. Кузнецова

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор П. Гереши

Редактор Н, Рогулич

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 3129 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва Ж-35, Раушская наб„4/5