Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа - 106 - деструктор диметилфенилкарбинола и фенола

 

Применение: очистка сточных вод от диметилфенилкарбинола и фенола. Сущность: штамм бактерий Pseudomanas putiria ВКПМ, В - 5249 выделен из образца почвы, взятого на территории предприятия, производящего фенол и ацетон мотором прямого высева почвенной суспензии на агаризованную питательную среду. Штамм может быть применен для локальной очистки сточных вод. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 02 03/34, С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ6СТВУ (21) 4854000/13 (22) 23.07,90 (46) 07.09.92. Бюл. N 33 (71) Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции. промышленных микроорганизмов (72) А,Ю.Федоров, В.И.Корженевич, И.Н.Сингирцев и В.Ю,Крестьянинов (56) Авторское свидетельство СССР

N 499224, кл, С 02 С 5/10, 1976.

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для очистки сточных вод от диметилфенилкарбинола и фенола.

Диметилфенил карбинол (ДМ Ф К) входит в состав сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом. Он получается как побочный продукт при распаде гидроперекиси изопропилбензола и концентрируется при отгонке фенола-сырца, Его содержание в сточных водах может резко увеличиваться при применении физикохимических методов обработки сточных вод, основанных на восстановлении гидроперекиси изопропилбензола, Диметилфенилкарбинол также образуется как промежуточный продукт при промышленном процессе получения а -метилстирола путем непрямога дегидрирования. изопропилбензола. Диметилфенилкарбинол является достаточно токсичным загрязнителем окружающей среды, предельно допустимая концентрация его в воде водоемов составляет 0,05 мг/л. (19) ЯЦ (11) 1 75979(4 А ) (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDQI(AONAS

PUTlDA 106 — ДЕСТРУКТОР ДИМЕТИЛФЕНИЛКАРБИНОЛА И ФЕНОЛА (57) Применение: очистка сточных вад от диметилфенилкарбинола и фенола. Сущность: штамм бактерий Pseudomanas putida

ВКПМ,  — 5249 выделен из образца почвы, взятого на территории предприятия, производящего фенол и ацетон мотором прямого высева почвенной суспензии на агаризованную питательную среду. Штамм может быть применен для локальной очистки сточных вод, 1 табл.

Фенол входит в состав сточных вод производства фенолформальдегидных смол, нитро- и хлорфеналов, фенолсульфакислот, капролактама, салициловой, пикриновой кислот и других ароматических соединений, его предельно допустимая концентрация в воде составляет 0,001 мг/л, По данным литературы штаммы микроорганизмов, способные утилизировать фенол, известны. Например, французские исследователи селектировали среди представителей рода нокардия штамм Nocardia

sp. В87, способный разрушать фенол в концентрации да 2000 мг/л, однако процесс деструкции требовал обязательного присутствия в среде дополнительного сточника азота и углерода.

Штамм Pseudomonas putida e -173 способен помимо фенола (300 мг/л за 8 ч при 30 С) утилизировать неионогенн..я поверхностно-активные вещества, но осу- . ществляет все эти процессы при культивировании на полноценной питательной среде, 1759794

20

35

55

Штамм Pseudomonas QT 31 утилизирует 500 мг/л фенола за 47 ч, а культура дрожжей использовала тол ько 200 мг/л в течение

24 ч, Поиск новых деструкторов фенола привел к обнаружению представителей рода

Streptomyces — Streptomyces setonii, способного метаболировать его по орто-пути расщепления ароматических соединений при 45 С и Candida — Candida tropicales HP

15, Недостатками этих штаммов являлось отсутствие у них способности разрушать помимо фенола диметилфенилкарбинол, хотя многие промышленные сточные воды характеризуются наличием именно таких сочетаний загрязнителей.

Наиболее близким к предлагаемому штамму Rseudomonas aeruginosa М 228, разрушающий фенол на 99,3 — 99,6% за 24 ч при исходном содержании в среде культивирования 200-300 мг/л (1). Недостатком этого известного штамма-деструктора фенола является отсутствие у него способности разрушать диметилфенилкарбинол.

Целью изобретения является получения штамма бактерий, способного утилизировать диметилфенилкарбинол, фенол при их совместном присутствии и сохраняющего свою деструктивную активность в сточных водах.

Предлагаемый штамм депонирован. во

Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ "Генетика" под регистрационным номером ВКПМ-5249, Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки. Молодые клетки штамма — короткие, утолщенные на концах палочки (2-3 мм), расположенные беспорядочно одиночно или попарно, Грамотрицательные, спор и капсул не образует, Культуральные свойства, На синтетический минеральной среде M 9 следующего состава, мг/л; NazHPO< 6000,0; КН2Р04

3000,0; NaCI 500,0, NH4CI 1000,0, содержащей ароматические соединения в качестве единственного источника углерода, после

72 ч инкубирования при 30 С образует колонии диаметром 1-1,5 мм неправильной круглой формы, гладкие, блестящие, края ровные.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб, подвижен, каталазо- и оксидазоположителен, желатиназу, амилазу, фенилаланиндезаминазу не образует. Образует аргининдигидролазу и уреазу. На среде

Хью-Лейфсона образует кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, сахарозы и мальтозы. На среде "Кинг-B" образует лимонно-желтый водорастворимый флюоресцирующий пигмент. В качестве единственного источника углерода может использовать глюкозу, сукцинат, L-глутаминовую кислоту, ацетат, Оптимальные условия культивирования на полноценных питательных средах рН

7,0+0,5, температура 30+1 С.

Условия хранения, Стерильные столбики с 0,75% МПА засевают уколом, инкубируют при 30 С 72 ч, заливают 1 мл стерильного вазелинового масла и хранят при 4 С; пересевают 2 раза s год.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм G FS 106 чувствителен к стрептомицину, мономицину, полимиксину, тетрациклину, рифампицину; устойчив к линкомицину, ристомицину, левомицетину, бензилпенициллину, олеандомицину, эритромицину, карбомицину, Патогенные свойства. При внутрибрюшном заражении беспородных белых мышей (10 животных на пробу) взвесью суточной культуры штамма в концентрации 1 млрд, микробных тел/мл в объеме 0,5 мл на животное заболевания не обнаружено.

Срок наблюдения 7 дней. Это дало основание считать культуру штамма непатогенной.

На основании комплекса морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как

Pseudomonas putida, Пример 1, Получение штамма GFS106, Штамм Pseudornonas putida GFS-106 был выделен из образца почвы, взятого на территории предприятия, производящего фенол и ацетон, методом прямого высева почвенной суспензии на агаризованную среду М9 следующего состава, мг/л;

Ка НРОа 6000,0, КН РО4 3000,0; NH4CI

1000,0; NaCI 500,0; диметилфенилкарбинол

500,0; агар-агар 1500; рН 7,0+0,2.

Выделенную культуру пассировали по плотным средам того же минерального состава, постепенно повышая содержание в ней диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода с 500 до

775 мг/л, отбирая наиболее крупные колонии.

На среде, содержащей в качестве единственного источника углерода 0,775 г/л диметилфенилкарбинола, роста данной культуры не наблюдалось. Клоны, отобранные с плотной синтетической минеральной среды М9 с содержанием диметилфенилкарбинола 0,75 г/л, проверяли на способность к утилизации этого субстрата при культивировании на жидкой среде того же состава в колбах на 250 мл, содержащих

100 мл среды. Изменение содержания ди1759794 метилкарбинола в среде культивирования контролировалось спектрофотометрически, Таким образом, методом направленной селекции был получен штамм бактерий GFS-106, способный к утилизации диметилфенилкарбинола в концентрации

750 мг/л, Дальнейшие исследования показали, что в спектр деструктивной активности данного штамма входит также фенол (ДО 350 мг/л), Пример 2. Использование штамма

GFS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Суточную культуру штамма GFS-106, выращенную на полноценной питательной среде, отмывали трехкратным центрифугирование при 6000 об/мин в 0,9 -ном раствоое хлористого натрия. 1 мл суспензии (10 клеток/мл) вносили в колбу на 250,0 мл, содержащую 100 мл неагаризованной минеральной среды М9 (состав среды см, пример

1) и 750 мг/л диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили на круговой качалке (110-135 об/мин) при температуре инкубации 28-30 С, Изменение концентрации диметилфенилкарбинола в среде культивирования контролировалось методом газовой хроматографии и спектрометрии (пик оптической плотности данного вещества 251 нм).

Через 96 ч культивирования описываемого штамма концентрация диметилфенилкарбинола в среде снизилась на 98,6% и составила 10 мг/л, что является пределом чувствительности методов определения.

Пример 3. Использование штамма

G FS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола в условиях периодического культивирования в лабораторном ферментере, Суспензию клеток штамма GFS-106 в

0,9 /-ном растворе хлористого натрия, приготовленную аналогично примеру 2, в количестве 5 мл вносят в 600 мл синтетической минеральной среды М9 (состав среды см. пример 1), содержащей 750 мг/л диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода. Рабочий обьем ферментера 0,75 л, скорость подачи воздуха 0,8 л/мин, частота вращения магнитной мешалки 500 об/мин, температура культивирования 30 С, Изменение содержания диметилфенилкарбинола в среде культивирования контролировали методом газовой хроматографии и спектрофотометрии.

Через 72 ч культивирования предлагаемого штамма в данных условиях содержа5

55 ние диметилфенилкарбинола в среде культивирования снижалось на 98,6 и составляло 10 мг/л, что является пределом чувствительности методов определения.

Пример 4, Использование штамма

GFS-106 в качестве деструктора фенола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изменение процесса утилизации фенола описываемым штаммом проводили по схеме, изложенной в примере 2 с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо диметилфенолкарбинола использовали фенол в концентрации 350 мг/л. Изменение содержания фенола в среде культивирования контролировали спектрометрически (пик оптической плотности субстрата 270 нм).

Через 96 ч культивирования штамма укаэанных условиях содержание фенола в среде культивирования снижалось на 52%.

Дальнейшей утилизации субстрата не происходило иэ-эа накопления неидентифицированных метаболитов в среде культивирования.

П р и и е р 5. Использование штамма

GFS-106, иммобилизованного включением в гель агара, в, качестве деструктора фенола.

Клетки предлагаемого штамма иммобилизовали включением в гранулы агара.

Для этого суспензию бактериальных клеток смешивали с раствором агара и вносили в охлажденное вазелиновое масло.

Сформировавшиеся гранчлы отмывали, 20,0 г биоканализатора (510 клеток/г) поб мещали в 800 мл синтетической минеральной среды М9 (состав среды по примеру 1), содержащей 350,0 мг/л фенола в качестве единственного источника углерода. Изменение содержания фенола в среде кул ьтивирования контролировали спектрофотометрически и фотоколориметрически с помощью цветной реакции с 4-аминоантипирином.

Через 48 ч культивирования штамма при указанных условиях фенол в среде культивирования данным, методом не определялся.

Таким образом, иммобилизация включением в гель агара позволяла бактериальным клеткам штамма осуществить утилизацию фенола в концентрации 350 мг/л полностью, Пример 6, Использование штамма

G FS-106 в качестве деструктора диметилфенилкарбинола и фенола в сточных водах, Изучение процессов утилизации диметилфенилкарбинола и фенола аналогичны примеру 2, с тем отличием, что в качестве

1759794

Составитель А. Федоровов

Техред М,Моргентал Корректор Н. Бучок

Редактор Л. Волкова

Заказ 3151 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 среды культивирования использовалась сточная вода производства фенола, содержащая диметилфенилкарбинол в концентрации 520 мг/л, фенол 32 мг/л, а также ацетон, ацетофенон, а-метилстирол, органические кислоты, Через 72 ч культивирования ни один из указанных компонентов сточных вод в среде культивирования методом газовой хроматографии не определялся. Результаты испытания биодеструктивной активности предлагаемого штамма, а также штаммапрототипа приведены в таблице.

Штамм P, aeruginosa М 228 разрушает фенол в концентрации 200-300 мг/л в течение 24 ч, а описываемый штамм GFS 106 в иммобилизованном состоянии 350 мг/л в течение 48 ч.

Предлагаемый штамм, хотя и не превосходит прототип по деструктивной активности по отношению к фенолу, но способен утилизовать диметилфенилкарбинол в концентрации до 750 мг/л в течение

72-96 ч в зависимости от условий культивирования.

Испытания штамма в реальных промышленных сточных водах, содержащих фе5 нол и диметилфенилкарбинол, показали его жизнеспособность. Наличие в сточных водах незначительного количества ацетона, ацетофенола, а -метилстирола, органических кислот не снижает биодеструктивной ак10 тивности описываемого штамма бактерий.

Таким образом, штамм обладает высокой деструктивной активностью, прошел испытания в образцах реальных промышленных сточных вод и может быть рекомен15 дован для локальной очистки сточных вод как от диметилфенилкарбинола или фенола по отдельности, так и от их совместного присутствия в сточных Водах.

20 Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida

В КПМ В-5249 — деструктор диметилфенилкарбинола и фенола.