Штамм бактерий yersinia еnтеrосоliтiса серовара 03, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза

 

Использование: медицинская микробиология , диагностика - использование в качестве эталонного корпускулярного антигена для реакции агглютинации (РА) с целью серодиагностики иерсиниоза Сущность изобретения: чистую культуру штаммя ГИСК № 189 выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при 37°С в течение 18-24ч. С помощьюО,85%-ного стерильного раствора хлорида натрия смывают бактерии с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 1/00, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4902269/13 (22) 14.01.91 (46) 30,07.92, Бюл. ¹ 28 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им, Пастера и Рязанский медицинский институт им. . акад. И.П.Павлова (72) И.В.Смирнов и Г.Я.ценева (53) 576,851.49(088.8) (56) "Микробиологическая диагностика иерсиниозов в Советский Армии и на ВоенноМорском Флоте"; Методические рекомендации, M.: МО СССР. 1984, с. 22 — 24, Эпидемиология, клиника, лабораторная диагностика и меры профилактики псевдотуберкулеза человека: Методические рекомендации, М„ Мз РСФСР, 1988, с. 27-29, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ JERSINIA

ЕЙТЕ ЙОСО0Т1 СА СЕ РО ВАРА 03, И С ПОЛ ЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ АНТИГЕНАДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ИЕPСИНИОЗА (57) Использование; медицинская микробиология, диагностика — использование в качестве эталонного корпускулярного антигена для реакции агглютинации (PA) с

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя иерсиниоза, используемый в качестве эталонного корпускулярного антигена для реакции агглютинации с целью серодиагностики иерсиниоза в диагностической и научно исследовательской работе.

Серодиагностика иерсиниоза. наряду с бактериологическим исследованием, является основным методом лабораторной диагностики этой инфекции. В ряде случаев из-за невозможности диагностировать иер„„5U,, 1751196 А1 целью серодиагностики иерсиниоза. Сущность изобретения: чистую культуру штамма

ГИСК № 189 выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при 37 С в течение 18-24 ч. С помощью 0,85% -ного стерильного раствора хлорида натрия смывают бактерии с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования (5000 д х 15 мин), Затем суспензию используют для постановки PA либо непосредственно (в виде живой культуры), либо после обработки формалином (в конечной концентрации 0,2 об.%) в течение 20-24 ч при комнатной температуре (в виде инактивированной культуры). Перед использованием концентрацию суспензии доводят по оптическому стандартумутности до 10 кл/мл.

PA с сывороткой крови и готовым антигеном ставят и учитывают общепринятым способом, смешивая до 0,5 мл антигена с таким же объемом сыворотки в разведениях от

1:25 до 1:1600. Положительная реакция s титре 1:200 и выше, а также динамика титров в парных сыворотках позволяютдиагностировать иерсиниоз. 1 табл. синиоз по клиническим признакам и неэффективности бактериологического метода (позднее сроки заболевания, внутриклеточная локализация возбудителя и др.), серодиагностика является практически единственным методом подтвеожления диагноза, Используемые для серодиагностики реакции — реакция агглютинации (PA) и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) — неравнозначны, oocKoëüêó в первом случае в сыворотке крови больных выявляются антитела к антигенам целых клеток возбудителя, во втором — к выделен1751 196 ному из них липополисахариду, фиксированному на поверхности эритроцитов (коммерческие эритроцитарные диагностикумы).

Применяемый в PA для серодиагностики иерсиниоза антиген должен представлять. собой гомогенную взвесь микробных клеток (живых или инактивированных) эталонного, лучше местного, штамма с типичными свойствами и той же антигенной структурой, которая выражена в период пребывания возбудителя в организме человека. Последнее особенно важно, так как для иерсиний характерно температурозависимое выражение целого ряда физиологических характеристик, в том числе многих антигенов.

В качестве антигена для PA используют референтные штаммы из международных коллекций. Одним из таких штаммов является Y,entегоcolitlca № 134 (Международный центр по иерсиниям, Париж), который используют для серодиагностики заболеваний, вызываемых иерсиниями серовара ОЗ.

Штамм № 134 принят за прототип.

Известна использование эталонного штамма в качестве антигена для РА, Перед приготовлением антигена у него проверяют культурально-морфологические свойства на питательном агаре, селекционируют колонии в S-форме, выращивают микроорганизмы на слабощелочном агаре (Хоттингера или MllA) при 17 — 24 С в течение 24 — 36 ч, Для приготовления антигена используют взвесь, полученную после смыва агаровой культуры, непосредственно (живая культура) или после обработки микробной взвеси формалином (убитая культура), Недостатком при использовании штамма f+ 134 является то, что для получения гомогенной взвеси клеток, культуру выращивают при температуре ниже 30 С, когда у микроба имеются жгутики и выражен Кантиген, а часть поверхностных антигенов, принимающих участие в патогенеэе, не выражена, Их выражение происходит при температурном режиме макроорганиэма (37 С). Повышение температуры инкубирования до 37 С приводит к спонтанному хлопьеобраэованию в микробной взвеси изза появления гидрофобных компонентов в наружной мембране клеток, что в свою очередь обусловлено функционированием в клетках штамма f4 134 плазмиды вирулентности с молекулярной массой 40-48 МД, Образование хлопьев в контроле антигена является йрепятствием для PA с культурой, выращенной при 37 С.

Цель изобретения — получение штамма

Y.entегоcolltica серовара 03, обладающего выраженной антигенной активностью беэ признаков спонтанной агглютинации. используемого в качестве антигена для РА, Полученный штамм Y,еп1егосоП11са ¹

955L депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А,Тарасевича (N 189, справка N 0107/115).

Морфологическая и физиологическая характеристики.

Грамотрицательные палочковидные клетки 0,5х1,1 мкм, подвижные при температуре ниже 30 С за счет перитрихиально расположенных жгутиков; при 37 С неподвижны, жгутиков не образуют. Спор и капсул не образуют, При культивировании на жидких средах (МПВ, бульон Хоттингера, 20 среда Кларка), независимо от температурного режима, образуют равномерное помутнение и небольшой компактный осадок, Ка среде Эндо через 24 ч при 37 С образуют колонии диаметром 0,2 — 0.3 мм, выпуклые, круглые с ровным краем, бесцветные, гладкие, прозрачные, пастообраэной консистен25 ции; через 48 ч — диаметром 1,5 — 2,0 мм, розовые. Сходную морфологию имеют колонии на агаре Хоттингера. Свойством каль30 цийзависимости штамм не обладает.

Биохимическая активность, Ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, маннит, мальтоэу, глицерин, сорбит, трегалозу, не ферментирует лактозу, рамнозу, салицин, эскулин, ксилозу, дульцит, Обладаетуреаэой, каталазой, орнитиндекарбоксилазой, Не образует индол, сероводород, Цитрат не утилизирует, фенилаланин не дезаминирует. Проба с ме35 эу — отрицательная, Фогес-Проскауэра— положительна при 26 С и отрицательна при

370С, Антигенные свойства.

Вступает в реакцию агглютинации с адсорбированной диагностической сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом

Y.entегоcolltica серовара 03 из международной коллекции, Обладает общим энтеробактириальным антигеном и групповыми антигенами, Спонтанную агглютинацию не дает.

Генетические особенности.

Штамм не содержит обычную для патогенных иерсиний плазмиду вирулентности с мол. м. 40 — 48 МД, гены которой контролируют синтез гидрофобных компонентов клеточной поверхности, а также свойства аутоагглютинации и кальцийзависимости.

40 тиловым красным положительна, на оксида1751196

Вместе с тем, этот штамм (как и родитель- 1:600 в объ е 0 5 о ъеме, мл путем двукратных разскии ) содержит низкомолекулярную . ведений. На агаре Хоттингера при 37"С в

R-плазмиду, контролирующую его устойчи- течение 24 ч выращена культура шт. ГИСК вость к стрептомицину. Он устойчив также к М 189. После приготовления смыв ц у, е а-лактамным антибиоти- 5 вания бактерий в физиологическом раствосмыва и отмыкам,эритромицинуилинкомицину;чувстви- ре суспензия стан а т телен к тет а иклин р циклину, левомицетину. оптическомустандартумутностидо10 кгlмл. полимиксину. Готовый антиген по 0,5 мл внесен во все

Штамм получен путем селекции на каль- разведения сыворотки больного, кроме цийдефицитной среде из популяции исход- 10 1;25, куда добавлено 0,5 мл физиологическоного кальцийзависимого штамма 9558, гораствора(контрольсыворотки). Вотдельвыделенного в 1988 г. в Рязани от больного ной пробир е с 0,5 ирке смешано, мл суспензии иерсиниозом,Штамм955$типиченпосвой- антигена и 05 м ф и, мл физраствора (контроль ствам, характерным для возбудителей иер- антигена). синиоза серовара 03; для него характерно 1I5 Для постановки PA с известным антигеналичие плазмиды 40-48 МД и связанных с ном на агаре Хоттингера при 24 С в течение ней некоторых признаков вирулентности, 36 ч выращена культура шт, М 134, После аутоагглютинации и кальцийэависимости. приготовления смы

В отли ия мыва культура суспензироотличие от родительского, штамм вана в физрастворе до 10 кл/мл и по 0,5 мл про ирки другого ряда тех же

955L обладает сниженным потенциалом па- 20 внесена в пробирки г r тогенности. Не проявляет вирулентности разведений сыворотки больного, поставлен при конъюнктивальном заражении морских соответствующий контроль а к энтеральном заражении мышей. Аналогичным образом поставлена реакПри заражении культуры ткани НЕр-2 (Зх ция агглютинации с антигенами из культур: х10 кл/мл) отмечается умеренная адгезия 25 Y,entегоcolltica М 134, Y.entегоcolitica cepo и инвазия эпителиоцитов, вйутриклеточное вара 09 М 201, а также Е.coli и Злурй, размножение отсутствует.

Использование штамма ГИСК В 189 втечение 24ч, После встряхивания пробиросуществляют следующим образом. ки выдержаны 2 ч при 37 С и l8 и

Чис ю к льт при и ч при комистую культуру штамма выращивают 30 натной температуре. Результаты приведены на плотной питательной среде (МПА, Хот- в таблице. о тингера) при 37 С в течение 18-24 ч. С по- Следует отметить, что титр антител в мощью,85% стерильного раствора отношении предлбженного штамма нехлорида натрия смывают бактерии с агара и сколько выше титра к- референтному штамдважды отмывают их в том же растворе пу- 35 му М 134, хотя в обоих случаях антитела тем центрифугирования (50009х15мин). За- определяются в диагностйческйх титрах, тем суспензию используют для постановки За счет перекрестно-ре ли о непосредственно (в виде живой тигеноввыявленытакжеантитела;вдиагнокультуры), либо после обработки формали- стическом титре (1;200) — к бесплазмидно пла мидному ом (в конечнои концентрации 0,2 об.g) в 40 штамму возбудителя иерсиниоэа 09., в ниэтечение 20 — 24 ч при комнатной температуре ких титрах — к другим энтеробактериям. (в виде инактивированной культуры). Перед . Выявление антител к шт. ГИСК М 189 в использованием концентрацию суспензии высоких титрах позволяет серологически доводят пооптическомустандартумутности подтвердить диагноз иерсиниоза 03 у больдо 10 кл/мл, Реакцию агглютинации с сы- 45 ного К. вороткой крови и готовым антигеном ставят и учитывают общепринятым способом, как легким течением бактериологически подправила, смешивая по 0,5 мл антигена с твержденного иерсиниоза (выделены иертаким же объемом сыворотки в разведениях синии ceровара 03) 3от 1:25 о 1 1600. от: до: 600. Положительная реакция в 50 заболевания взята кровь для серологичетитре 1:200 и выше, а также динамика тит- ского исследования, Приготовлены двуров в парных сыворотках позволяютдиагно- кратные разделения сыворотки крови от стировать иерсиниоз, 1:25 до 1:1600 в объеме 0 5 . Н МПА р и м е р . больного К., 12 лет, со 37ОС в течение 18 ч выращена культура шт, средне-тяжелымтечением кишечной инфек- 55 ГИСК М 189. После приготовления смыва и ции из кала выделены Y.entегоcolitlca серо- отмывания в физ. растворе суспензия клевара 03. В конце 3-й нед заболевания взята ток стандартизована до 10 кл/мл. Затем к кровь для серодиагностики, После отделе- ней добавлен формалин до 0,2 (по обьения от сгустка сыворотка разведена 0,85 - му); инактивированный антиген испольэоным раствором хлорида натрия от 1:25 до ван через сутки после выдерживания

1751196

Формула изобретения

Штамм бактерий Yersinia entегоcoiitica

ГИСК М 189 серовара 03, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза, ыворотки крови больного К, с антигена9 и других энт роба ь прозрачна; р р

** учету не подлежит.

Составитель И. Смирнов

Редактор Н. Швыдкая Техред М.Моргентал Корректор И. Шулла

Заказ 2664 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, yn,Ãàãàðèíà. 101 суспензии при комнатной температуре. В обьеме 0,5 мл антиген внесен в пробирки с разведениями сыворотки; поставлены, как обычно, контроли сыворотки и антигена.

Пробирки выдержаны 2 ч при 37 С и 20 ч при 5

20 С. При учете выявлен диагностический титр антител — 1:200, Параллельная постановка PA с аналогичным антигеном из шт.

М 134 позволила выявить антитела, но в титре ниже диагностического (1:100). Следо- 10 вательно, при использовании антигена иэ шт. ГИСК N 189 подтвержден диагноз иерсиниоза.

Таким образом, предлагаемый для использования в качестве антигена с целью 15 серодиагностики иерсиниоза штамм ГИСК

М 189 имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом.

При использовании шт, ГИСК N.. 189 появляется возможность сохранения гладкой 20 формы иерсиний при 37 С, отсутствие маскирующего действия Н-антигена и связанных с плазмидой вирулентности антигенов повышает специфичность получаемого эн25

Результаты учета реакции агглютинации с ми иерсиний сероваров 03, 0 тигена для серодиагностики. В РА выявляются антитела в более высоких титрах, чем с помощью прототипа, что повышает частоту серологического подтверждения иерсиниоэа, особенно в сомнительных случаях.

Штамм выделен на территории СССР и имеет типичные биологические характеристики для циркулирующих в стране иерсиний серовара 03. Предложенный штамм не подвержен диссоциации при культивировании на питательных средах и не требует трудоемкого клонирования для восстановления

$-формы. Выраженная активность шт, ГИСК

N- 189 позволяет испольэовать приготовленный из него антиген в качестве активного препарата для РА, Работа с предложенным штаммом более безопасна для персонала.