Способ получения полипептида со свойствами фактора некроза опухоли

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для получения человеческого фактора некроза опухолей (ФИО). Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности In vivo при низкой цитотоксической активности in vitro. Способ заключается в том, что конструируют плазмиды pHPL-115, pH PL147, pHPL-Ser. трансформируют ими штамм бактерий E.coll HB 101, культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)я С 12 N 15/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4202872/13 (22) 19.06.87 (46) 15.09.92. Бюл. М 34 (31) 145575/86 (32) 20.06.86 (33) JP (71) Дайниппон Фармасьютикал Ко., Лтд (J Р) (72) Юнити Ямагиси, Хитоси Кавасима, Рюдзи Фурута, Хиротада Котани и Катухиса Наката (J Р) (56) Е Р N- 0155549, кл. С 12 N 15/00, 1985.

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для получения человеческого фактора некроза опухолей (ФНО).

Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности in vlvo, при низкой цитотоксической активности ln

vItro.

Способ заключается в том, что. конструируют плазмиды pHTP16V, рНТР31Т, pHTP32S. pHTP32D, рНТР32Н, рНТР36Ч, рНТР73Р, рНТР98Н, рНТР103Р, рНР1-115, рНЙУ-32, рНТР115Н. pHTP115D, pHTP115S, рНТР1156, рНТР115Т, рНТР117Н, рНТР1311, pHTP143V, трансформируют ими штамм Е.соИ НВ 101 культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Пример 1. Построение зкспрессионной плазмиды pHNY-32.

Клонированную кДНК, кодирующую человеческий ФНО, выделяют обработкой зн.ЫЛ „1762761 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА

СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА

ОПУХОЛИ (57) Изобретение относится к медицине и биотехнологии и мож т быть использовано для получения человеческого фактора некроза опухолей (ФНО). Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности 1п viva при низкой цитотоксической активности in Иtro. Способ заключается в том, что конструируют плазмиды

pHPL-115, рН PL147, рНР(=Бег, трансформируют ими штамм бактерий E.coll НВ 101, культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта. донуклеазами растрикции Pst1, используя рекомбинантную плазмиду pHTNF13, полученную по методике, описанной в Европейской патентной публикации ¹ 155549.

Клонированную кДНК дополнительно обрабатывают зндонуклеазами рестрикционными Ave l u HInd И! для выделения ДНК фрагмента, содержащего основную часть области кодирования полипептида человеческого ФНО. Выделенный ДНК-фрагмент называют ФНО-ДНК-фрагментом.

ФНО-ДНК-фрагмент имеет размер около 600 п.о.

ФНО-ДНК-фрагмент затем обрабатывают зндонуклазой рестрикции эндонуклеаз

Нра II u Bgl И для разрезания его на три

ДНК-фрагмента. Фрагменты выделяют. Эти

ДН К-фрагменты названы, соответственно фрагмент ДНК-1, фрагмент ДНК-2 и фрагмент ДНК-З.

Затем фрагменты ДНК-1 и ДНК-3 комбинируют, используя Т4-ДНК-диагазу со сле1762761 (a) 5 -CGGGCCTATGCCCTCC-3

3 -CCGGATACGGG-5 5

Связанный ДНК-фраг"лент именуют фраплентом NY-ДНК. Фрагмент NY-ДНК последовательна связывают со следующими двумя химически синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными адаптерами (Ь) 1 и (с) (Ь)5 -AACTAGTACGCAAGTTC AGGTAAG GAGGTTATC-3 .

3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGCTA-5 (с)5 -GATTATGTCATCTTCTCGAACC-3

3 -ATACAGTAGAAGAGCTTGGGGG1-5

Результирующий ДНК-фрагмент именуют пептидо-кодирующим ДНК-фрагментам.

ДНК-фраплент (размером около 380 п.о.), содержащий trp проматорную область, выделяют из плазмиды рСТ-1 с помощью двойной обработки эндонуклеазами Нра I u

Aat Il. Последовательность оснований 1грпромоторной области указанного ДНКфрагмента в 380 п.о. известна. Указанный

ДНК-фрагмент 380 из п.о. связывают с пеп- 2 тидо-кодирующим ДН К-фрагментом, как это описано выше, Связанный ДНК фрагмент именуют промотор-пептидокадирующим ДН К-фрагментом.

Отдельно от этого, плазмиду pBR322 аб- 3 рабатывают эндонуклеазами рестракции

Ача! и Pvu II, и результирующий ДНК-фрагмент (размером около 3,7 т,п.о.) выделяют с помощью гельэлектрафореза в 0,7% агарозе. После заполнения области между его липкими. концами и тупыми концами с использованием ДНК-полимеразы 1 Е.coll (фрагмент Кленова) и четырех видов дезоксирибонуклеотидотрифосфатов (дГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ), оба конца связывают 4 с помощью Т4-ДНК-лигазы для построения новой плазмиды, которая обозначена

p8RS6.

Плазмиду pBRS6 расщепляют эндонуклеазами растрикции Aat И и Hind III на два 4

ДНК-фрагмента. ДНК-фрагмент (размеры около 3,6 т.п.о) выделяют и связывают с помощью Т4-ДНК-лигазы с прамогорпептидокодирующим ДНК-фрагментом, полученным выше, для построения экспрессионной плазмиды рНМУ-32. Для получения полипептида

ФН0-32У, содержащего 155 аминокислот, и с аминакислатнай последовательностью, в которой аспарагиновый остаток в 32-ом положении ат N-конца заменен тирозином (Tyr), 2. Получение ФНО-32У

Экспрессианную плазмиду pHNY-32 вводят в Е.coll НВ101 обычным способом (S.N,Cohen и др., Proc, Natl. Acad. Scl США, 69, 2110 (1972)).

50 мМ буфера Трис-H CI {pH 8), содержащего

О, l% лизозима и 30 мМ NaCI, и оставляют на 30 мин на ледяной бане. После неоднократной обработки клеточной суспензии за20 мораживанием в бане с сухим льдом в этаноле и оттаиванием при 37 С клеточный экстракт отделяют центрифугированием.

Клеточный экстракт диализуют относительно 20 мМ буфера Трис-HCI (рН 7,8) и

Содержащие целевой полипептид фракции собирают, объединяют и концентрируют ультрафильтрованием с Диафло на

50 мембранах УМ10 (Амико).

И наконец, концентрат подвергают гельфильтрации на колонке Биогель Р-6 (Био-Рад) с применением в качестве элюента 5 мМ фосфатного буфера в солевам рас55 творе и получением очищенного ФНО-32У (выход 20,8 мг/л).

N-концевую аминокислотну а последовательность очищенного ФНО-32У с помощыа автоматического разложения по

Эдм-ну на приборе для определения аминадующим химическим синтезированным олигодезоксирибануклаостидн ым адаптером

Трансформант (Н В101)рН ЙУ-32) культивируют при 37 С около суток в LB-бульоне (состав: 1 о/ триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCI, рН 7,5). Культурой инокулируют 10 объемов среды IVI9 (состав: 1,5%

Иа2НРОа.12НрО, 0.3% КН2РОа, 0,05% NaCI, 0,1% NH4CI, 2 мг/л витамина В1, 0,45% казаминокислоты, 1 мМ MgS04, 0,1 мМ CaCI2 и 0,4% глицерина). содержащей ампициллина в концентрации 25 мкг/мл (37ОС, 1 ч), Затем добавляют 3-индолакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мл.

После этого культивирование продолжают еще 24 ч и клетки отделяют центрифугираванием. Полученные клетки суспендируют в центрифугированием диализата получают осветленную жидкую часть. Жидкую часть наносят на колонку с ДЭАЗ-Сефарозай С16В (фармация), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером Трис-HCI (рН 7,8).

После промывания колонки тем же буфером с целью удаления неадсорбированных компонентов целевой полипептид (ФНО-32У) элюируют в условиях линейного градиента концентрации NaCI от нуля до 0,3 M в том же буфере. Каждую фракцию подвергают электрофорезу на НДС-полиакриламидном геле и фракции, содержащие полипептид с молекулярным весом около 17 килодальтон, собирают и обьединяют. Объединенные фракции диализуют относительно 20 мм буфера Трис-HCI (рН 7,8) и вновь подвергают коланочной хроматографии на ДЭАЭ вЂ” Сефарозе С1=6В в вышеприведенных условиях, но с элюированием более легким градиентом концентрации NaCI.

1762761

50 кислотных последовательностей (Эпплайд

Виосистемс, модель 470А).

В результате установлено, что N-концевой аминокислотой Ф НО-32У является остаток серина, т.е. метиониновый остаток, обусловленный кодоном запуска тринсляции (ATG) удален из очищенного продукта, Пример 2. 1. Построение зкспрессионной плазмиды pHPL-115.

ФНО-ДНК-фрагмент, полученный в примере 1 (1), обрабатывают эндонуклеазами Рчц II u Tag дпя разрезания его на четыре ДНК-фрагмента. Фрагменты выделяют.

Эти ДНК-фрагменты именуют, соответственно, фрагмент ДНК-4. фрагмент ДНК-5, фрагмент ДНК-6 и фрагмент ДНК-7. Фрагмент ДНК-5 дополнительно обрабатывают эндонуклеазой Ddll и получают ДНК-фрагмент именуемый фрагментом ДН К-8.

Фрагмент ДНК-8 комбинируют с фрагментом ДН К-4. а затем связывают со следующими двумя химически синтезированными олигодезоксирибоиуклеотидньили адаптерами (d) и (е). (d) 5 -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT- 3

3--CCGGTTCGGGACCATACTCGA-5 (е) 5 -CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG-3

3 -GTAGATAGACCCTCCCCAGAAAGGTC-5

К полученному ДНК-фрагменту, используя Т4-ДНК-лигазу, дополнительно привязывают фрагмент ДНК-6 и фрагмент ДНК-7.

Результирующий ДНК-фрагмент именуют

PL-ДН К-фрагментам.

Экспрессиониую плазмиду pHPL-115 строя по методике прииера 1, но вместо

NY-ДНК-фрагмента используют Р1=ДНКфоагмент.

2. Получение ФНО-115!

По методике примера 1-(2) получают трансформант HB101(pHPL-115).

Трансфориант (H8101(pHPI -115) культивируют в течение ночи при 30 С в бульоне

LB (состава: 1 триптона, 0,5 дрожжевого экстракта, 1 NaO, рН 7,5). Культуру инокулируют в 10 обьемах модифицированной среды М9 (1,5 NazHPO4 12НгО; 0,3

КН2РО4. 0,057 NaCI, 0.1 NH4CI, 2 иг/л витамина В1,0,45 касаминовой кислоты, 1 мМ MgzS04, 0,1 мМ CaClz и 0,4 глицерина) содержащей ампициплин в количестве 25

MKf/ìë, при 37 С в течение 1 ч, Затем добавляют 3-индалакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мп.

После этого культивирование дополнительно продолжают в течение 24 ч. клетки собирают центрифугираааиием, cy" пеидируют в

50 MM буфера т рис-HU (рН 8), годержащего

0.14 лизоцима и ЗР и(! Г1аС!, и оставляют в ледяной ванне в течение 30 мии. После этого суспензию клеток многократно обрабатывают замораживанием (сухой лед-этанол) и оттаиванием (при 37 С), клеточный экстракт собирают центрифугированием.

Клеточный экстракт диапизуют B буфере

20 мМ трис-HCI (ðÍ 7,8), диааизат центрифугируют. !-!адосадочную жидкость наносят на колонку ДЭАЗ-Сефароза CL-GB, предварительно уравновешенную с помощью 20 мМ буфера трис-НС! (рН 7,8). После промывки колонки тем же буфером для удаления неадсорбированных компонентов, требуемый полипептид элюируют с использованием линейного градиента концентрации NaCI от

0 до 0,3 М в том же буфере, Каждую фракцию подвергают ДСН-полиакриламидному гельэлектрофорезу и фракции, содержащие полипептид, имеющий молекулярную массу около 17 килодапьтоиов, собирают и обьединя ют.

Обьединеиную фракцию диализируют относительно 20 мМ буфера трис-HCI (рН

7,8), а затем ее снова подвергают хроматографии в колонке ДЭАЭ-сефароза CL-6В описанным образом, но элюироваиие проводят в условиях более слабого градиента концентрации NaCI.

Фракции, содержащие целевой полипептид собирают, объединяют и концентрируют с помощью аппарата "Диафлоу" с использованием мембраны УМ10.

Наконец, концентрат подвергают гельфильтрации на колонке "Байо-Гель Р-6" с использованием содержащего фосфатный буфер сапевого раствора в качестве элюеита для получения очищенного ©H0z-115! .

3. Определение амииокислотной последовательностисти, Аминокислотиые последовательности очищенного ФНО-115 и его пептидиого фрагмента анализируют с помощью автоматизированного разложения по Эрдману иа приборе для определения последовательности аминокислот в белках

Пептидный фрагмент получают в следующих условиях, 500 мкг очищенного

Ф НО-115! инкубируют с 10 мкг лизил-эндопептидаэы в 5 иМ буфера трис-НС! (рН 8), содержащего 4 M мочевину в общем обьеме

0,1 мл. После инкубироваиия при 35 С в течение 15 ч, результирующие переваренные пептиды выделяют высокоэффективной жидкостью и хроматографией, в условиях пинейноградиентного элюироваиия ат 10 до 507 ацетонитрипа, содержащего 0,07 трифторуксусной кислоты, в 0,1% трифторуксусиой кислоте, при расходе 1 мп/мии в течение 60 иин. Пептидные фрагменты выделяют из каждой фракции и подвергают и .

1762761 аминокислотные последовательности анализу с помощью метода автоматического разложения по Эдману.

Подтверждено. что аминокислота в положении 115 от (=конца ФНО-115L является лейциновым остатком.

N-концевая аминокислота очищенного

ФНО-115L я ляется сериновым остатком. что указывает на удаление метионинового остатка, обусловленного кодоном запуска трансляции (ATG).

Пример 6. Получение других полипептидных мутантов-1 человеческого ФНО;

1. Построение экспрессионных плазмид.

Экспрессионную плазмиду для получения полипептида. состоящего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, в которой аспарагиновый остаток в положении 32 ат N-конца заменен другой аминокислотой, например

Hls, Asp u Ser строят по методике примера

2-(1), за исключением того, что вместо синтетического адаптера (а) используют один из приведенных ниже химически синтезированных олигодезоксирибонуклеотидных адепторов:

5 -CGGG CCCACG CCCTCC-3

3 -CCGGGTGCGGG-5 (для замены остатком Hls)

5 -CGGGCCGATGCCCTCC-3

3 -CCGGCTACGGG-5 (для замены остатком Asp) или

5 -CGGGCCAGCGCCCTCC-3

3 -CCGGTCGCGGG-5 (для замены остатком Ser).

Эти плазмиды обозначены как соответственно: рНТР32Н, рНТР320. pHTP32S.

2. Получение полипептидного мутанта человеческого ФНО.

Каждую из. экстрессионных плазмид, полученных в разделе 1, вводят в Е;соИ

НВ101 традиционным методом, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2), Целевой полипептид очищают от клеточного экстракта по методике примера

2-(2).

Пример 7. Получение других полипептидных мутантов-2 человеческого ФНО.

1. Построение экспрессионных плазмид.

Экспрессиоиную плаэмиду для получения полипептида, состоящего иэ 155 аминокислот N имеющего аминокислотную последовательность, в которой пролиновый остаток в 115-м положении от й-конца заменен другой аминокислотой. например $ег, Asp u 6ly строят по методике примера 2(1): за исключением использования одного из

10

35 следовательности от аминокислоты М 1 до

N. 155 в табл.1, в которой тирозиновый ос45

30 химически синтезированных олигодезоксирибонуклеотидных адаптеров. приведенных ниже, вместо синтетического адаптера (б):

5 -Т6А66ССАА6СССТ66ТАТ6А6ТССАТ-3

3 -CCGGTTCGGGACCATACTCAG-5 (для замены остатком Ser)

5 -TGAGG CCAAG CCCTGGTATGAGGACAT-3

3 -CCGGTTCGGGACCATACTCCC-5 (для замены остатком Asp)

5 -TGAG6CCAAG CCCTGGTATGAGGG CAT-3

3 -СС66ТТС666АССАТАСТССС-5 (для замены остатком 6!у).

Эти плазмиды обозначены как

pHTP115S, pHTP115D, pHTP115G1. соответственно.

2. Получение полипептидных мутантов человеческого ФНО.

Каждую из экспрессионных плазмид, полученных в разделе 1 вводят в Е.coll

НВ101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид выделяют и очищают из клеточного экстракта по методике примера 2-(2).

Пример 8. Получение полипептидного мутанта ФНО 117Н-человеческого ФНО, обозначенного Ф НО-117Н, 1. Построение экспрессионных плазмид.

Экспрессионную плаэмиду для получения полипептида, состоящего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую потаток в 117-м положении с N-конца заменен на другую кислоту, например His строят по методике примера 2-(1), за исключением использования приведенного ниже химически синтезированного олигодезоксирибонуклеотидного адаптера вместо синтетического адаптера (е):

5 -CCATCTGGGAGGGGTCTTCCAG-.Ç

3 GTAGGTAGACCCTCCCCAGAAGGTC-5

Данная плазмида обозначена как рНТР117Н.

2. Получение ФНО-117Н

Экспрессионную плазмиду, полученную в разделе(1) вводят в Е.coll Н 8101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид выделяют и очищают из клеточного экстракта по существу по методике примера 2-(2).

Пример 9. Получение других полипептидных мутантов ФНО человека, По методике примера 2-(1) конструируют экспрессионные плазмиды: рН 1Р16 для получения ФНО-16V, pHT< 31Г ллч 6>l<0

1762761

31Т, рНТР36Ч вЂ” для ФНО-36V, pHTP73P— для ФНО-73Р, рНТР98Н вЂ” для ФНО-98Н, pHTP103P — для ФНО-103Р, pHTP115T — для

ФНО-115Н, рНТР115Н вЂ” для ФНО-115Н, рНТР1311 — для ФНО-1311 и pHTP143 — для

ФНО-143V, которыми трансформируют

Escherichla соИ. Трансформанты культивируют и затем полипептиды выделяют и очищают по методике примера 2-(2) со следующими результатами:

ФНО-16V — полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 16-ый А!а заменен Ча! (выход

17,5 мг/л);

Ф HQ-31Т вЂ” полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 31-ый Ala заменен Thr (выход 26,4 мг/л);

Ф НО-36Ч вЂ” полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 36-ой Ala заменен Ча! (выход 8,9 мг/л):

Ф НО-73Р— полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 73-ий Leu заменен Pro (выход 2,1 мг/л);

Ф НО-98Н вЂ” полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), s которой 98-ой Pro заменен His (выход 3,2 мг/л);

ФНО- IOÇP — полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 103-ий Thr заменен Pro (выход 15,9 мг/л);

ФНО-115Т вЂ” полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ы и Р ro заменен Thr (выход 20,5 мг/л);

ФНО-115Н вЂ” полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ый Pro заменен His (выход 23,2 мг/л);

ФНО-1311 — полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 131-ый Ser заменен Ие (выход 17 мг/л);

ФНО-143 — полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 143-ий Ala заменен Val (выход 16,5 мг/n), Формула изобретения

Способ получения полипептида со свойствами фактора некроза опухоли, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК с мутацией в гене, кодирующем фактор некроза опухоли, трансформацию полученными ДНК штаммов Escherichia coll, культивирование, выделение и очистку конечного продукта с последующим определением аминокислотной последовательности и целевого белка, отличающийся тем, что, с целью повышения противоопухолевой активности

5 in vlvo, при низкой цитотоксической активности In ч!тго конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pHTP16V, рНТР31Т, рНТР325, рНТР320, pHTP32H, pHNY-32, pHTP36V, рНТР73Р, рНТР98Р, рНТР103Р, 10 рНР -115, рНТР115Н, pHTP115D, pMTP 115S, р НТ Р1156, р НТР115Т, рНТР117Р, рНТР1311 или pHTP143V, трансформируют плазмидами бактерии штамма

- Escherichia roll MB101, а очистку целевого

15 продукта осуществляют нанесением клеточного лизата на колонку с ДЭАЭ-Сефарозой, уравновешенную 20 мМ трис-HCI буфером при рН 7,8, элюирование проводят с помощью линейного градиента концентрации

20 NaCI от 0 до 0,3 М в том же буфере, затем осуществляют полиакриламидный гельэлектрофорез, полученнун. фракцию диализуют с помощью 20 мМ буфера трис-HCI рН 7,8 и наносят на колонку с ДЭАЭ-Сефарозой, 25 а элюирование проводят с помощью слабого градиента NaCI, элюат концентрируют, концентрат подвергают очистке гельфильтрацией с использованием фосфатсодержащего буфера в качестве элюен30 та, при этом целевой белок характеризуется следующей аминокислотной последовательностью.

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

Ча! Ala His Val Val А!а Asn Pro Glu А!а

35 Glu Gty Gln Leu Gln Trp Leu Asn Aro Arg

Ala Asn Ata Leu Leu Ara Asn Gly Vai GIu

Leu Агд Asp Asn Gin Leu Vat Vai Pro Ser

Glu Gty Leu Tyr Levite Tyr Ser Gtu Val

Leu Phe Lys Gty Gin 6!у Cys Pro Ser Thr

40 His Vai Leu Leu Thr His Thr Ие Ser Arg !!е Ata Val Ser Tyr 6!и Thr Lys Val Asn

Leu Leu Ser Ala !!е Lys Ser Pro Cys Gin

Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

Pro Trp Tyr Glu Pso Ие Туг Leu 6!у Gly

45 Val Phe Gtn Leu Giu Lys Gly Asp Aro Leu

Ser Ala Glu ite Asn Arg Pro Аэр Tyr Leu

Asp Phe А!а Glu Ser Gly Gin Va! Туг Phe

Gly lie Ие Ala с заменой 16-й аминокислоты Ala на Ча!

50 31-ой -"-Ala-* - Thr

326-ой -"- Asn -"- Asp, His, Ser или Tyr

36-ой -"- А!а -"- Ча!

73-ей -"- Leu -"- Pro

98-ой -"- Pro-"- Hts

55 103-ей -"- Thr -"- Pro

115-ой -"- Pro -"- Leu, His, Ser, Gly, Asp или

117-ой-"- Tyr-"- His

131-ой -"- Ser -"- Ие

143-ей -"- А!а -"- Val