Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций

 

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях, в пищевой и микробиологической промышленности, бродильном производстве. Цель изобретения -снижение себестоимости и упрощение технологии изготовления индикаторного тест-устройства. Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций представляет собой капсулу, выполненную из прозрачного термостойкого материала, составные части которой содержат слой истинного студня для нанесения образца и Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях, а пищевой и микробиологической промышленности , бродильном производстве. Цель изобретения - упрощение технологии изготовления и снижение себестоимости . Индикаторное тест-устройство выполнено в виде капсулы, в которой слой для реагенты, которые также могут быть включены в студень. Причем слой для нанесения образца и слой студня, содержащий реагенты , пространственно отделены друг от друга и находятся в разных частях капсулы. После контакта с исследуемым образцом в течение нескольких минут части капсулы, содержащей слой для нанесения образца, капсулу герметизируют и опускают в теплую воду, температура которой не превышает 60°С. За несколько минут пребывания в таких условиях студни, находящиеся в капсуле, расплавляются , смешиваются, что инициирует протекание реакции, сопровождающейся изменением цветности. Визуальная оценка интенсивности окраски позволяет судить о концентрации анализируемого соединения в исследуемой пробе с ошибкой не более 25%. В случае применения фотометра с помощью индикаторной тест-капсулы можно проводить количественный анализ. Для формирования студней используют желатину , агар-агар и некоторые другие соединения . Конструкция индикаторныхтест-капсул фактически позволяет реализовать любой спектрофотометрический способ анализа субстратов ферментативных реакций. 3 ил. нанесения образца пространственно отделен от реагентов, причем некоторые из реагентов , как и слой для нанесения образца, выполнены на основе истинных студней. Устройство индикаторной тест-капсулы показано на фиг. 1 и 2, где 1 - части капсулы, 2 - крышки, используемые для герметизации реагентов внутри частей капсулы при транспортировке иди хранении. На фиг. 3 показана капсула в сборе, где 1 - манжета Ё «.„А Ч О 00 о N N5

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ!

1,, 1 ©

;QQ . 0 ф

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4397829/13 (22) 28.03.88 (46) 15.10.92. Бюл. N 38 (71) Институт химической физики АН СССР (72) Я. А. Александровский (56) Авторское свидетельство СССР

N 1155944, кл. С 12 0 1/26, 1985.

Выложенная заявка ФРГ

hb 3510992, кл. С 12 M 1/40, 1985. (54) ИНДИКАТОРНОЕ ТЕСТ-УСТРОЙСТВО

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ

СУБСТРАТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ (57) Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях. в пищевой и микробиологической промышленности, бродильном производстве. Цель изобретения-снижение себестоимости и упрощение технологии изготовления индикаторного тест-устройства. Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций представляет собой капсулу, выполненную из прозрачного термостойкого материала, составные части которой содержат слой ис-, тинного студня для нанесения образца и

Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях, в пищевой и микробиологической промышленности, бродильном производстве.

Цель изобретения — упрощение технологии изготовления и снижение себестоимости.

Индикаторное тест-устройство выполнено а виде капсулы, в которой слой для

„„ Ы„„1768642 A l (si)s С 12 Q 1/26 реагенты, которые также могут быть включены в студень. Причем слой для нанесения образца и слой студня, содержащий реагенты, пространственно отдалены друг от друга и находятся в разных частях капсулы, После контакта с исследуемым образцом в течение нескольких минут части капсулы, содержащей слой для нанесения образца, капсулу герметизируют и опускают в теплую воду, температура которой не превышает 60 С.

За несколько минут пребывания в таких условиях студни, находящиеся в капсуле, расплавляются, смешиваются, что инициирует протекание реакции, сопровождающейся изменением цветности, Визуальная оценка интенсивности окраски позволяет судить о концентрации анализируемого соединения в исследуемой пробе с ошибкой не более

25%. В случае применения фотометра с помощью индикаторной тест-капсулы можно проводить количественный анализ, Для формирования студней используют желатину, агар-агар и некоторые другие соединения. Конструкция индикаторных тест-капсул фактически позволяет реализовать любой спектрофотометрический способ анализа субстратов ферментативных реакций. 3 ил. нанесения образца пространственно отделен от реагентов, причем некоторые из реагентов, как и слой для нанесения образца, выполнены на основе истинных студней.

Устройство индикаторной тест-капсулы показано на фиг. 1 и 2, где 1 — части капсулы, 2 — крышки, используемые для герм".Tèçàции реагентов внутри частей капсулы при транспортировке или хранении. На фиг. 3 показана капсула в сборе, где 1 — манжета

1768642 любой конструкции, используемая для герметизации реагентов вну гри капсулы в процессе проведения анализа, Капсула может быть изготовлена из лю.бого термостойкого прозрачного материала, например, стекла или пластмассы.

Размеры капсулы, за исключением ее внутреннего диаметра, не имеют принципиального значения. Внутренний диаметр определяет количество субстрата, поступившего из образца в капсулу. Каждую часть капсулы используют для формирования в ней слоя для нанесения образца либо реакционного слоя, либо для хранения реагентов, не вошедших в реакционный слой.

Выбор хранения реагентов в сухом виде или помещение их в реакционный слой, равно как и количество реакционных слоев, зависящее от числа реагентов, определяется условиями, необходимыми для длительной сохранности реагентов, и условиями проведения реакции. Формирование указанных слоев проводят на.основе соединений, образующих при температуре до 30 С истинные студни, способных изменять свое агрегатное состояние. в зависимости от температуры /гель-раствор/. К таким соединениям относятся желатина, агар-агар. поливиниловый спирт, метилцеллюлоза и некоторые другие, Так, например, при температуре до 30 С 10 о/, раствор желатины представляет собой студень. а с повышением температуры легко расплавляется с образованием раствора, в котором коэффициент диффузии низкомолекулярных соединений практически не отличается от коэффициента диффузии в воде.

Определение концентраций субстратов ферментативных реакций с помощью индикаторных тест-капсул проводят следующим образом: на слой для нанесения образца помещают на определенное время несколько капель исследуемого раствора. В течение этого времени в слой студня происходит диффузия ниэкомолекулярных соединений и, в частности, анализируемого соединения.

Количество продиффундировавшего субстрата будет прямо пропорционально его концентрации в образце /и диаметру части капсулы, содержащей слой для нанесения образца/, который удаляют смыванием мягкой струей воды или встряхиванием. Капсулу герметизируют, соединяя с другими ее частями. содержащими реакционные слоя и реагенты, и помещают в теплую воду /с температурой не ниже 37 С и не выше

60 С/ В результате чего студень расплавляется, слой для нанесения образца и реакционные слои смешиваются, растворяя сухие реагенты, что инициирует ферментативную

55

Пример 2. Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации зтилового спирта.

Приготовление реакционного слоя; 1 г желатины, 20 мг алкогольоксидаэы, 10 мг фенола, 20 мг пероксидазы, 20 мг 4-аминоантипирина, 10 мг аэида натрия и 10 мг семикарбаэида растворяют при 40-45 С е 10 мл фосфатного буферного раствора /0,2 M рН 7,8/, содержащего 1 мМ ЭДТА, 100 мкл реакцию. Через 5-15 мин после начала реакции производят сравнение окраски индикаторной тест-капсулы со стандартной шкалой.

5 Пример 1. Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации глюкозы.

Приготовление реакционного слоя: 1 r

>келатины, 20 мг глюкозооксидаэы, 10 мг фенола, 20 мг пероксидазы, 20 мг 4-амино10 антипирина и 10 мг азида натрия растворяют при 40-45ОС в 10 .мл фосфатного буферного раствора /0,05 M рН 7,2/. 100 мкл приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсу15 лы /высота 15 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление слоя для нанесения образца: 1 г желатины, 10 мг фенола и 10 мг азида натрия растворяют при 40-45ОC а 10

20 мл фосфатного буферного раствора /0,5 М рН 7,2/. 100 мкл приготовленного раствора помещают. в другую половину /высота 10 мм, внутренний диаметд 4 мм/ индикаторной тест-капсулы.

25 Определение концентраций глюкозы с помощью индикаторных тест-капсул проводят следующим образом: в анализируемый раствор помещают на 2 мин половину капсулы, содержащую слой для нанесения об-.

30 раза. Через указанный интервал времени зту часть капсулы извлекают, промывают водой, соединяют с другой половиной, содержащей реакционный слой, и помещают в термостат /50"С/ на 10 мин, после чего

35 сравнивают окраску капсулы со стандартной шкалой, изготовленной при использовании калибровочных растворов. Диапазон анализируемых визуально /по интенсивности окраски/ концентраций глюкозы с по40 мощью приготовленных таким образом индикаторных тест-капсул составляет 5-26 . мМ, Материал, из которого изготовлены тест-капсулы - стекло. Герметизацию капсулы осуществляют с помощью небольших

45 трубочек /длиной не более 4 мм/, полученных разрезанием силиконового шланга, которые плотно одевают на обе половинки капсулы при соединении их торцами.

1768642 приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсулы

/высотв "5 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Конструкция тест-капсулы, состав слоя для нанесения образца и последовательность операций при выполнении определе- 5 ния аналогичны примеру 1.

П р им е р 3. Индикаторныетест-капсулы для определения концентрации мочевины.

Приготовление реакционного слоя: 0,1 г 10 агар-агара, 170 мг уреазы, 20 мг бромтимолового синего, 15 мг азида натрия растворяют при 50 С в 10 мл аммоний-цитратном буферном расторе /0,01 М рН 6,5/, содержащем 1мМ ЗДТА, 100 мкл приготовленно- 15 го раствора помещают в одну из половин

/высота 15 мм, внутренний диаметр 4 мм/ индикаторной тест-капсулы, Приготовление слоя для нанесения образца: 0,1 r агар-агара и 15 мг азида натрия 20 растворяют при 50 С в дистиллированной воде /с помощью слабого раствора щелочи рН воды доводят до 6,2/ обьемом 10 мл 100 мкл приготовленного раствора помещают в другую часть капсулы /высота 10 мм, внут- 25 ренний диаметр 4 мм/, Конструкция тест-капсулы и последовательность операций при выполнении апределения аналогичны примеру i. Переход от светло-зеленого до синего окрашивания 30 коррелирует с изменением концентрации мовечины в образце в диапазоне 2-13 мМ.

Пример 4. Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации этанола.

Приготовление слоя для нанесения об- 35 разца: 0,1 г агар-агара и 10 мг азида натрия растворяют при 50 С мл глицин — NaOH буферного раствора /0,5 M рН 9,4/, 200 мкл приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсулы 40

/высота 25 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление 1-го реакционного слоя:

0,1 г агар-агара, 10 мг никотинамидадениндинуклеотида /НАД / и 10 мг эзида натрия растворяют при 50 С в 10 мл глицин-HCI буферного раствора /0,02 M рН 3,5/. 100мкл приготовленного раствора помещают в.другую половину индикаторной 1с(, I I .-. nñji 1bl

/высота 10 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление 2-ro реакционного слоя .

20 мг диафоразы /НАДН-дегидрогеназы/, 10 мг тетразолия, 10 мг семикарбэзида, 20 мг алкогольдегидрогеназы и 10 мг азида натрия растворяют при 45 С в 10 мл 1 / раствора агар-агара, приготовленного на основе фосфатного буфера /0,02 M рН 7,0/.

100 мкл раствора помещают в среднюю часть капсулы /высота 10 AM, внутренний диаметр 4 мм/, которая представляет собой стеклянную трубку указанных размеров, закрывающуюся с обеих сторон небольшими пробками. Аналогичные пробки закрывают также и две другие части капсулы при ее хранении, транспортировке, что предупреждает механическое повреждение слоев, их зарастание и загрязнение.

Формула изобретения

Индикаторное тест-устройство для оп-. ределения концентраций субстратов фер-ментативных реакций, состоящее из подложки, одного или нескольких слоев реагентов и слоя для нанесения анализируемого образца, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью упрощения технологии изготовления и снижения себестоимосги„подложка представляет собой разьемную капсулу, выпролненную по крайней мере из двух частей и из прозрачного термостойкого материала, слой для нанесения образца выполнен на основе истинного студня и размещен в одной из частей капсулы, а слои реагентов, один или несколько из которых выполнены также на основе истинных студней, размещены в других частях капсулы.

1768642

Составитель А. Семенов

Техред M.Mîðãeíòàë Корректор И.шмакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Редактор В. Трубченко

Заказ 3622 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/6