Способ получения культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеns, обладающей хитиназной активностью

 

союз соВетских

СОЦиАЛИСТИНЕСКИх

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4887682/13 (22) 04.12,90 (46) 07.11.92, Бюл, N. 41 (71) Казанский государственный университет им, В.И.Ульянова-Ленина и Вышневолоцкий завод ферментных препаратов (72) Д, В. Юсупова, О. В, Порфирьева, В,П.Варламов, P.Á.Ñoêoëoâà, О.С.Синявина и Г.В. Комарова (56) Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А., Рылкин

С.С. Хитиназа Serratia marcescens BKM В851. — Прикладная биохимия и микробиология. 1976, т.12, вып.4, с.581 — 586.

Авторское свидетельство СССР

N1бб1214,,кл. С 12 N 9/14, 1989.

Авторское свидетельство СССР

N- 1730146, кл. С 12 N 9/42, 05.02,90. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Serratia marcescens, ОБЛАДАЮЩЕЙ ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к .получению внеклеточной хитиназы

S.marcescens (К,Ф,3.2.1.4), которая может быть использована для биоконверсии хитинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений, в качестве биохимического реактива при качественном и количественном определении хитина, для разрушения клеточной стенки дрожжей.

Известны способы получения культу-ральной жидкости с хитиназной активностью с использованием штаммов В КМ В-851 (1), 1-10 P).

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ

„„5Ц „„1773939А1 (51)5 С 12 N 9/42 //(С 12 N 9/42, С 12

R 1; 43) (57) Использование: биотехнология, может быть использована для биоконверсии хитинсодер>кащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, в качестве биохимического реактива при количественном и качественном определении хитина в составе клеточной стенки грибов и других биологических объектов, для борьбы с насекомыми, для разрушения клеточной стенки грибов. Сущность изобретения: в качестве продуцента хитиназы используют мутантный штамм Serratia marcescens ВКПМ В4870, который выращивают в течение 48 ч на среде, содержащей, г/л: кристаллический хитин 10,0 — 30,0; кукурузный экстракт 2,55,0; КгНРОп ЗН20 4,0; MgSO4 7Н20 0,9; рН среды 8,5 t-30 С. Активность культуральной жидкости достигает в среднем 2000 мкМмл

1 -1 ч, удельная активность — 1210 мкМ.мг белка .ч . 1 табл. получения культуральной жидкости с хитиназной активностью, в котором штамм 41410 выращивается на среде, содержащей коллоидный хитин в качестве источника углерода и азота, дрожжевой экстракт в качестве источника витаминов, культивирование проводится в течение 96100 ч (3j.

Недостатками прототипа являются необходимость получения хитина в коллоидной форме, что требует дополнительно времени, реактивов и оборудования; длительное время культивирования; относительно низкая активность фермента в культуральной жидкости.

Целью изобретения является получение культуральной жидкости с высокой хитиназ1773939 ной активностью на среде с кристаллическим хитинам.

Поставленная цель достигается путем культивирования продуцента Ялпагсезсепэ

BKflM В-4870 (21 при оптимальной температуре и аэрации в одной питательной среде, содержащей КгНР04 ЗН20; MgSO< 7Н20, кристаллический хитин в концентрации

10,0 — 30,0 г/л, в качестве источника витаминов — кукурузный экстракт в концентрации

2,5 — 5,0 г/л, а культивирование проводят в течение 48 ч. Применение данного способа ,позволяет повысить хитиназную активность культуральной жидкости в 5 — 6 раз па сравнению с прототипом.

Пример 1. При постановке опытов испольэовали питательную среду следующего состава. г/л; кристаллический хитин

10,0; К2НР04 3H20 4,0, М93047Н20 0,9, дрожжевой экстракт 0 25, рН среды 8,5.

Подготовка посевного материала. Культуру S.marcescens ВКПМ В-4870 выращивают в течение 1 сут в пробирках со скошенным мясо-пептанным агаром при

30 С, Выросшие клетки смывают 0,5 -ным раствором NaCI, Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 0,05 оптических единиц (Д65о) на 1 мл среды.

Постановка опыта. Посевной материал засевают в конические колбы с 200 мл питательной среды. Отношение обьема питательной среды в к объему колбы 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при

30 С в течение 72 ч. Пробы отбирают через каждые 24 ч. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 16000g в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют хитиназную активность и содержание белка по методу Лаури.

Определение хитиназной активности.

Хитиназную активность определяли па количеству образующегося при гидролизе коллоидного хитина й-ацетил-Д-глюкозамина с динитросалициловым реактивом.

Инкубационная смесь обьемом 1 мл содержит 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,75, 0,4 мл коллоидного хитина (12,5 г/л), 0,1 культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют при 50 С в течение 30 мин, Затем пробы разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, охлаждают,негидралиэованный хитин отделяют центрифугированием при 7000g в течение

10 мин, а в надосадочной жидкости определяют количество N-ацетил-Д-глюкозамина.

Для этого к пробе 1 мл добавляют равный объем реактива, содержащего динитросалицилавую кислоту, и нагревают в кипящей

55 за исключением того, что в среде изменяли концентрацию хитина от 10,0 да 30,0 r/ë, концентрацию дрожжевого экстракта от

0,25 да 2,0 г/л, заменяли дрожжевой экстракт на кукурузный экстракт в концентрации 2,5-5,0 г/л. Примеры 2-18 и полученные результаты приводятся в таблице, Как видно из таблицы, наблюдается повышение активности хитиназы в среде при увеличении концентрации хитина до 30 г/л, активность хитинаэы увеличивается при этом на 250,(,.

Дальнейшее повышение концентрации хитина в среде нецелесообразно с экономической точки зрения.

Оптимальной концентрацией дрожжевого экстракта для биосинтеза хитиназы является концентрация 0,5 г/л. Повышение концентрации дрожжевого экстракта не вызывает повышения активности фермента.

Замена дрожжевого экстракта (0,5 г/л) кукурузным экстрактом в концентрации 2,5 водяной бане в течение 15 мин. Пробы охлаждают и измеряют поглощение при 570 нм. Количество N-ацетил-Д-глюкозамина рассчитывают по калибровочной кривой. 3а единицу активности хитинаэы принимают количество фермента, которое при гидролизе коллаидного хитина освобождает 1 мкМ

N-ацетилглюкозамина 1 ч инкубации.

В качестве субстрата используют хитин фирмы Серва или мелко размолотый хитин завода им. Вайкова, Коллоидный хитин получают следующим образом. К 1 г тонка размолотого хитина добавляют последовательно 5 мл ацетона и 30 мл концентрированной соля. ной кислоты при постоянном перемешивании. Полученную однородную взвесь фильтруют через стеклоткань так, чтобы фильтрат поступал в колбу, содержащую 1,5 л 30% этанала при постоянном перемешивании. Через 2 ч хлопья каллоидного хитина отделяют центрифугированием при 3000g в течение 30 мин и отмывают от кислоты дистиллированной водой до нейтрального рН, Коллоидный хитин дополнительно гомагенизируют, диализуют в течение 1 сут против воды и используют в опытах.

На питательной среде, где в качестве источника углерода и азота использовали кристаллический хитин в концентрации 10 г/л и в качестве источника витаминов- дрожжевой экстракт в концентрации 0,25 г/л, активность хитиназы в среде составляет через 24 ч 100 ед/мл и 220 ед/мг белка; через

48 ч — 300 ед/мл и 440 ед/мг белка; через 72 ч — 385 ед/мл и 380 ед/мг белка.

Пример ы 2-18. В дальнейшем выращивание бактерий и определение хитиназной активности проводили, как в примере 1, 1773939

Формула изобретения

Способ получения кул ьтурал ь ной жидкости Serratia marcescens, обладающей хитиназной активностью, путем культивирования продуцирующего микроорганизма при оптимальной температуре биосинтеза и аэрации в водной питательной среде, содержащей хитин, источник витаминов, К2НР04 ЗН20 и MgS04 7HzO, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм $еггаба marcescens ВКПМ В4870, хитин используют кристаллический в концентрации 10,0-30,0 г/л, в качестве источника витаминов-кукурузный экстракт в концентрации 2,5 — 5,0 г/л, а культивирование проводят в течение 48 ч.

Компонент среды, г/л

Хитиназная активность, алйиЬ е /мг белка/ч

Пример

Дрожжевой экстракт.

В емя к льтиви овэния, ч

Хитин

Кукурузный экстракт

24

0,25

20

0,25

0,25

10

0,50

0,50

0,50

1,00

1,00

30

1,00

2,00

10

2,00

2,00

10

2,50

20

2,50

2,50

5,00 г/л по сухому веществу равноценна и не снижает активности хитиназы в среде. Кукурузный экстракт является отходом производства, он более дешев и доступен по сравнению с дрожжевым экстрактом и ши- 5 рока применяется в ферментной промышленности.

Максимальный уровень хитиназной активности достигался при использовании кристаллического хитина в концентрации 10

30,0 г/л, кукурузного экстракта в концентрации 2,5 г/л, при выращивании в течение 48ч .и был равен 2000 ед/мл и 1210 ед/мг белка.

Сравнение хитиназной активности в культуральной жидкости, полученной дан- 15 ным способом, с описанными ранее показывает, что предлагаемый способ позволяет увеличить. активность хитинэзы в среде в

5-6 раз по сравнению с прототипом.

1QQ

2И

2Д.

11Q

15Q

129

191

1К

160 .И0

19(9

240 10

113

423

25Q

2 2

120

680 520

90Q

620 7

ЕЫ

9QQ

2Q0Q

KQ

650

МЕ0

668

1294

606 И0

562

3К.

IL7Q

ИЮ

1И0

720 й5

480

1773939

Продолжение тэблйМИ

Составитель О. Порфирьева

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор IVI. Андрушенко

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3908 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5