Штамм культивируемых клеток павиана гамадрила papio намаdrylаs, используемый для получения лимфотропного ретровируса павианов типа с и в качестве тест-объекта для характеристики моноклональных антител т-клеточной специфичности

 

Использование: биотехнология, экспериментальная онкология. Сущность: получение штамма культивируемых клеток павиана гамадрила Papio Hamadryas, продуцирующего лимфотропный ретровирус павиана типа С. Штамм может быть использован и для тестирования Моноклональных антител Т-клеточной специфичности. Штамм получают путем .культивирования мононуклеарной клеточной фракции селезенки павиана гамадрила в присутствии рекомбинантного интерлейкина - 2(рИЛ-2). Более 80% клеток штамма имеют антигенные маркеры СД2 и СД4. На 90% клеток обнаружены рецепторы к рИЛ-2. 2 табл. (/ С ««А vi XI W

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„. Ы„„1774949 АЗ

{st)s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к медицине и вонковирусологических исследованиях и бибиотехнологии и может быть использовано отехнологии B качестве источника Т-лим(21) 4944102/13 (22) 11.06.91 (46) 07.11.92, Бюл. N 41 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии (72) В.З. Агрба, Б.А, Лапин, В.В, Тимановская, В.В, Какубава, Л,В. Инджия, Д.9. Аравиашвили и М.Г. Чикобава (73) В.3. Агрба, Б.А. Лапин, В,В, Тимановская, В.В. Какубава, Л:В. Инджия, Д.Э. Аравиашвили и M.Ã. Чикобава (56) 1. Iinuma Y, Retrovirus and adult Т-cell

leukemia//Science. 1984, 223, с.1195 — 1 l97.

2. Kamuro А., NIatanabe T„Miyoshi l. et al.

Detection and characterization of simian

retroviruses homologous to human Т-cell

virus type I//Virology. 1984, 138, с.373 — 378, 3.Miyoshl I., Kubonishi I„Yoshirnoto S., Shiraishi Y, А Т-cell line derived from normal

cord leukocytes by coculturing with human

leukemic T-сеПз//GANN. 1981, 72, с.978—

981.

4.Mlyoshl I„Fujishita M„Taguchi et а!

Natural infection in non human primates with

adult Т-сеи ieukemia virus or à closely related

agent//Int.J.Cancer. 1983, 32, с.333-336.

5.Pezzuto А., Behm F., Callard R.Å. et al.

Flow cytometry analysis of В-cell blind рапе joint report.//IV VVhorkshop, Oxford

press. 1990, с.165 — 174, 6.Агрба В,3., Яковлева Л.А., Тимановская В,B. и др, Штамм культивируемых клеток Papio hamadryas — продуцент лимфотропного герпесвируса павианов и ретровируса типа С из семейства

STLV-I//Авторское свидетельство

СССР ¹ 1640159, кл. С 12 N 5/00, 1989. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

ПАВИАНА ГАМАДРИЛА PAPIO

HAMADRYLAS, ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМФОТРОПНОГО РЕТРОВИРУСА ПАВИАНОВ ТИПА С И В КАЧЕСТВЕ

ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Т-КЛЕТОЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ (57) Использование: биотехнология, экспериментальная онкология. Сущность: получение штамма культивируемых клеток павиана гамадрила Рарю Hamadryas, продуцирующего лимфотропный ретровирус павиана типа С. Штамм может быть использован и для тестирования моноклональных антител Т-клеточной специфичности.

Штамм получают путем . культивирования мононуклеарной клеточной фракции селезенки павиана гамадрила в присутствии рекомбинантного интерлейкина — 2(рИЛ-2).

Более 80% клеток штамма имеют антигенные маркеры СД2 и СД4. На 90% клеток обнаружены рецепторы к рИЛ-2. 2 табл. 1774949 фотропного ретронируса обезьиl типа С (S1LV-I), а также в качестве тест-обьекта для выявления антигенов и характеристики моноклональных антител (МонАТ) Т-клеточной специфичности.

Аналогом изобретения является Тлимфоидная культура клеток человека

MT-2-продуцент вируса Т-клеточного лейкоза/лимфомы человека типа l(HTLV-I) (3).

Аналог был получен громоздким методом— путем сокультивиронания лейкемических клеток крови больного Т-клеточной лейкемией с лимфоцитами пупочного канатика человека. Клетки штамма, хотя и имеют хелперный фенотип, но идентифицированы с использованием ограниченного набора маркеров (51. Кроме того, в клетках аналога рвплицируется rlHpyc НТ1 Ч-) (1), сходный, Но не идентичный ретровирусу С-типа обезьян

STLV-! (2,4).

Прототипом изобретения является штамм культивируемых клеток павиана гамадрила Papio hamadryas (ВПЛ-П)-проду-цент лимфотропного герпесвируса и ретровируса типа C(STLV-I) (61, полученный в результате трансформации нормальных лимфоцитов клинически здоровых пав IaHoB лимфотропным герпесвирусом панианон (ГВП) и продуцирующий два типа лимфотропных онкогенных вирусов (ГВП и STLV-I), чта существенно осло>княет его использова-. ние н области экспериментальной онкологии, Клегки прототипа име ат также

В-клеточное происхождение и непригодны для тестирования МонАТ Т-клеточной специфичности.

В связи с указанным целью изобрете- . ния является получение стабильнога штамма Т-лимфоидной линии павиана гамадрила с его практическим использованием н качество источника чистой культуры Т-лимфотраппого ретравируса С-типа STLV- а также в качестве тест-обьекта для выявления антигенов Т-клеточной специфичности и характеристики МоНАТ к различным эпитопам рецепторов Т-клеток.

Штамм был получен путем культивирования MoHoHóêëaapíoé клеточной фракции селезенки павиана гамадрила К" 13583, погибшего от Т-клеточной лимфомы, Мононуклеары селезенки были выделены путем низкоскоростного центрифугиронания в градиенте плотности фиколл-вераграфина, дважды отмыты и ресуспендированы в питательной среде RPMI 1640 в сочетании с 15/, инактивированной прогреванием при 56 С

30 мин сыворотки плода коров в присутствии 300 мкг/мл 1-глютэл1инэ, 5х10 М 2-меркаптозтанолэ, 100 ед/и» пенициллина,.100 мкг/мл стрептомицина и 20 мкгlмл конканавалина А (Con А). Через 48 ч клетки осаждали, отмывали, ресуспендиравали н питательной смеси указанной рецептуры (без

Соп А) и добавляли 100 ед/мл рекомбинан5 тного интерлейкина-2 (рИЛ-2, МНТК "Биоген"). Добавление новых порций рИЛ-2 проводили через каждые 72 я культивирования. Культуру инкубировали в термостате о при 37 С н газовоздушной смеси, содер>ка10 щей 5% COz, при 100% влажности . Лимфобластоидная трансформация и становление культуры произошли на 37день культивирования.

1.Культуральные свойства и морфологи15 ческая характеристика.

Штамм СПГ-7(Т) является суспензианl-loA культурой, клетки которой находятся в жидкой фазе и растут без прикрепления к твердому субстрату. Ростовые характери20 стики клеток штамма следующие: время удвоения клеточной массы составляет 28-30 ч, максимальная клеточная плотность — б-, Ях10 кл/мл, число мертвых клеток колеблется в пределах 5 — 20%, посевная доза

25 составляет 1,5 — Zx10 кл/л1л, Клетки штамма хорошо переносят криоконсервацию. В качестве криопротектора используют 8%-ный диметилсульфаксид в эмбриональной сыворотке коров.

30 Штамм представлен одиночными лимфаидными клетками и их небо IbLLIMMN скоплениями. При окраске препаратов клеток по

Романовскому-Гимза выявляется морфалогическая структура лимфоблэстов, Клетки в

35 основном крупные с большил ядром и нежно-голубой цитоплаэмой. В ядрах клеток определяются нуклеолы. л

,Цитогенетическая характеристика;

Цитогенетический анализ; проводимый

40 методом окраски хромосом на В-диски, выявил наличие нормального кариотипа павиана гамадрила (Zn = 42,хх) при модэльном

-.классе хромосом, равным 42/30, и плоиднасти клеток (n = 300), равной 13,9/, 45 З.Характеристика вирагеннаго статуса клеток штамма. а) Методом блат-гибридизации по Саузерну в клетках штамма СПГ-7(T) была определена провирусная .ДНК STLV-I, 50 гомологичная прови русной ДН К HTLV-I из

ITLV-l-продуцирующих клеток МТ-4, на а гличающаяся от нее по сайтам рестрикции

ДНК. Количество интегрированной пронирусной ДНК STLV-I составляет 0,5-1 геном55 эквивалента на клетку. При этом имеет место моноклональный характер интеграции провирусной ДНК в клеточный генал . В свою очередь правирусная ДНК STLV-I из клеток СПГ-7(T) имеет также некоторые различия в сайтдх рестрикции ДНК от прони1774949 русной ДНК STLV-I в клетках прототипного штамма ВПЛ-П (6), б) В ультрацентрифугате культуральной жидкости штамма СПГ-7(Т) методом иммуноблотинга с использованием HTLV-I-положительной сыворотки человека, больного синдромом ATL(T-клеточная лейкемия/лимфома взрослых, обнару>кены основные структурные белки gag-комплекса ЗТБИ (р24 и р19, идентичные соответствующим белкам HTLV-I), в) Определение PHK-зависимой ДНКполимеразы проводили, используя ультра-. центрифугат культуральной жидкости

СПГ-7(Т). Было показано, что фермент предпочитает ионы Mg, а не Мп что характерно для вирусов атой группы.

4,Иммунологическая характеристика клсток штамма СПГ-7(Т).

Клетки штамма имеют Т-клеточный фенотип, так как более 80% клеток содер>кат пан-Т-клеточные антигены CD2, . выявляемые МонАТ этого кластера (9.6, 7Р4 — 7F10) и CDÇ (SP34), и не несут пан-В-клеточных антигенов кластера CD20 (IF15), В клетках штамма с высокой частотой обнаруживаются CD4-антигены, выявляемые с помощью МонАТ 19Thy-5D7 и МТ310 и не содержатся антигены кластера CD8 (MoAT G10-1 и 7РТ-ЗР9), Пример 1, Использование штамма

СПГ-7(T) в качестве источника ретровируса

С-типа STLV-(.

Культуральная жидкость штамма СПГ7(Т) в.объеме 1 л освобождалась от клеток центрифугированием при 1500g, 15 мин и далее при 10000g, 10 мин. Вирус осаждали при 5000g,4 ч, + 4 С, Осадок ресуспендировали в 1 мл буфера THE (0,01 M Tris-HCi, рН

7,2; 0,1 M NaCI; 0,001 M EDTA) и центрифугировали при 25000 об/мин, 17 ч, ротор

SW28, Бекман. Содер>кимое градиента фракционировали и собирали зону с плотностью 1,15 — 1,17 г/см, Материал разбавляли з

3 раза буфером THE и вирус осаждали при

200000g, 1 ч. Вирусный осадок ресуспендировали в 1 мл буфера THE и хранили при70ОС, В осадке методом детекции ревертазной активности определяли наличие вирионов STLV-f. К 100 мкл вирусной суспензии добавляли 10 мкл NOAIdat P-40 и 10 MKll лизата смешивали с 90 мкл реакционной смеси, содержащей 40 мМ Tris-HCI. рН 7,8;

4 mM дитиотрейтола; 45 mM KCI; 0,25 ОЕ2ео поли{рА)олиго(дТ), 15 мкм Н-ТТФ (уд. акт, 18 Кю/мМ); 10 мМ MgCI? или 0,25 MM МпС!2.

Инкубацию проводили при 37 С в течение 1 ч, Кислотонерас1воримую радиоактивность измеряли в толуоловом сцинтилляторе на сцинтилляционном счетчике SL4000 (Интертехник, Франция). Ревертазную реакцию

5 с (итали положительной, если включение

"Н-ТТФ в пробу было в 2 и более раз выше, чем в образце без добавления синтетической матрицы-затравки (см. табл.1), Таким образом показано, что штамм

20

55

СПГ-7(Т) является источником ретровируса

С-типа павианов гамадрилов STLV-i.

Пример .2, Использование клеток штамма СПГ-7(Т) для тестирования МонАТ

Т-клеточной специфичност., Клетки штамл а СПГ-7(T) тестировали с применением МонАТ к различным антигенал1 Т-клеток в реакции непрямой иммунофлюоресценции в модификации для монослоя живых клеток, прикрепленных к стеклу поли =лизином. Клетки в концентрации 1,5 млн. кл/мл наносили на стекла в лунки по 50 мкл. Предварительно стекла инкубировали с поли =лизином (50 мкг/мл) 30 мин при 37 С и затем дважды отмывали в фосфатно-буферном растворе(ФБР). Клетки инкубировали с полиЕ-лизином 30 мин при

37 С, отсасывали культуральную жидкость и наносили МонАТ, Инкубировали 30 мин при

+ 4 С,-после чего клетки отмывали 5 раз в

ФБР, содер>кащем 0,1% Камаз, и наносили вторую козью антимышиную,сыворотку

F(ab )г, коньюгированную ФИТЦ (Tago, США), в рабочем разведении 1:40. После контакта коньюгат отмывали 5 раз ФБР с

0,1% Камаз, после чего клетки заключали в

50%-ный раствор глицерина, приготовленного на ФБР (рН 7,2 — 7,4). Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе

0pton (ФРГ), просчитывая не л енее 200 клеток. Клетки с яркой поверхностной флюоресценцией считались положительными, Результаты эксперимента приведены в табл.2, Как следует из данных, представленных в табл.2, клетки штамма выявляют широкий диапазон Т-клеточных маркеров и пригодны для тестирования МонАТ Т-клеточной принадлежности.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток павиана гамадрила Papio Hamadrylas BCKK(I!) % 504

Д, используемый для получения лимфотропного ретровируса павианов типа С и в качестве тест-обьекта для характеристики моноклональных антител Т-клеточной специфичности.

1774949

Таблица 1

Результаты тестирования ревертазной. активности

Примечания: имп/мин пробы и ° - ° - ---- — 7И вЂ” имп мин пробы без матрицы

**- В-клеточная линия человека, продуциру(ощая герпесвирус Эпштейна-Барр, Клас

Таблица

Инмунофенотил клеток штамма СПГ-7(Т) 0-клеточные маркеры теры л (СД) СД2 СДВ ТСД28 С429 ь г

СД19 (СД20 (ХВИ (Поликлональные маркеры

НойАТ 9,6 7Р4- SP34 19тлу- ДТ 010-1 7РТ- 9.3

7F1O 507 310 3F9

fFS 2СЗ 10G Ьх

Ф клеток 91 Во 81 80 72 0,5 3 68

1,5

2,0 0 0 0 0

Составитель M,Ñåðîâà

Редактор ВЛОрчикова Техред М,Моргентал Корректор Л.Ливринец

Заказ 3943 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул.Гагарина, 101

Т-клеточные маркеры ..L". 1...."