Способ выделения грибов рода раесilомyсеs из патологического материала больных

 

Способ выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала больных. Использование: в области медицины , в частности в микологии, гематологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, аллергологии , и может приняться при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, септицемии , анемии, пневмонии, кожного или респираторного аллергоза. Сущность изобретения: производят забор крови или грудного молока, или мокроты, или кала больного, которые помещают в гепаринизированную среду 199 (Хенкса, Игла) (4,5 мл среды и 0.5 мл раствора гепарина) и выдерживают при комнатной температуре (25°С) в течение 18 - 24 ч с последующим распределением ее по поверхности агаровых сред. Рост колоний грибов рода Paecilomyces обнаруживается с 4 дня от посева, по которым, после их идентификации, ставят диагноз пециломикоз Способ позволяегповысить чувствительность до 44 - 73%. 2 табл сл С

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛ И СТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТ8Е ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4849297/14 (22) 20.07.90 (46) 07.11.92. Бюл. N. 41 (71) Самаркандский государственный медицинский институт им. И.П.Павлова (72) А.M.Àõóíîâà (73) А.М.Ахунова (56) Кашкин П.К, Заболевания, вызываемые грибами, Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней.

M „1964, с,547 — 683. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГРИБОВ РОДА

PAECILOMYCES ИЗ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО

МАТЕРИАЛА БОЛ6НЫХ (57) Способ выделения грибов рода

РаесНовусез из патологического материала больных. Использование: в области медицины, в частности в микологии, гематологии, Изобретение относится к медицине, в частности к микологии, инфекционным болезням, гематологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, аллергологии, и может быть использовано при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, септицемии, анемии, пневмонии, кожного или респираторного аллергоза.

До настоящего времени выделение грибов рода Paeciiomyces от больного человека относилось к казаустическим случаям и по данным литературных источников не превышало 1 — 1,5 что затрудняло диагностику заболевания, вызванного грибами этого рода.

В 1982 году З.А.Гиясов и соавторы предложили диагностику пециломикоза по способу выявления сержантеллоподобных. Ж«„1775047 А3 (s>Is G 01 N 33/48 пульмонологии, гастрознтерологии, аллергологии, и может приняться при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, септицемии, анемии, пневмонии, кожного или респираторного аллергоза. Сущность изобретения: производят забор крови или грудного молока, или мокроты, или кала больного, которые помещают в гепаринизированную среду 199 (Хенкса, Игла) (4,5 мл среды и 0.5 мл раствора гепарина) и выдерживают при комнатной температуре (25 С) в течение 18 — 24 ч с последующим распределением ее по поверхности агаровых сред, Рост колоний грибов рода Paecilomyces обнаруживается с 4 дня от посева, по которым, после их идентификации, ставят диагноз пециломикоз. Способ позволяет повысить чувствительность до 44 — 73%. 2 табл, образований (СПО), которые по их мнению являются оболочками гриба. Свое заключение они обосновали тем, что СПО были обнаружены в мазках периферической крови больных, от которых был выделен гриб

P.varlotiI, а также в мазках периферической крови животных, зараженных этим же видом гриба.,Такое обоснование постановки диагноза пециломикоза по выявлению СПО в мазках периферической крови было подвержено критике, так как специфического отличия оболочки гриба от, например, оболочки эритроцита авторы не предложили.

Известен способ культурального исследования, когда кровь собирают в растворы цитратной или оксалатной солей, затем распределяют ее по поверхности агаровых сред в чашках Петри или посевы небольших

1775047 комочков патологического материала, производят на поверхности среды нанесением минимальных комочков исследуемого материала в нескольких точках на расстоянии 1 — 2 см один от другого, Выращивание производят при 25" и 37 С раздельно. Рост грибов появляется на 3 — 5 день, но посевы рекомендуют выдерживать в термостате до

30 дней для окончательного суждения об отсутствии роста грибов.

Непригодность вышеуказанных способов для культурального выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала заключается в том, что тканевая паразитическая форма грибов Р,variotii и

P,viridis обладает особым пропизмом к внутриклеточному паразитированию и нуждается, по нашему мнению, в особых условиях культивирования. Быстрое изменение из среды обитания при посевах на обычные агаровые среды (Сабура сусло-агар и др,), приводит их к гибели и отрицательным результатам обследования.

Целью предполагаемого изобретения является повышение чувствительности метода.

Способ выделения грибов рода

Paecilomyces из патологического материала больных путем его инкубации на агаровой среде при температуре 25 С и микроскопического исследования для идентификации колоний грибов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, исследуемый материал предварительно выдерживают в гепаринизированной среде

199 в течение 18 — 24 ч при температуре

25о

Новым в предложенном техническом решении предварительная инкубация материала в гепаринизированной среде 199.

Способ осуществляют в 2 этапа, 1-й этап исследований.

После предварительной обработки спиртом мякоти безымянного пальца делают укол индивидуальным стерильным копьем по упора, У каждого пациента кровь берут стерильным капилляром от аппарата

Панченкова, откуда затем в равных частях переливают в две стерильные пробирки, содержащие по 5,0 мл гепаринизированной среды 199. Забор мокроты, грудного молока, кала, мочи осуществляется в количестве

1 0 мл стерильные чашки Петри, Взятие образцов патологического материала от больного осуществляют непосредственно в момент исследования, Из 1-й пробирки не позднее 15 — 20 мин от момента забора патологического материала стерильной пипеткой производят забор крови (грудного молока, мокроты, мочи или

20 6,0 — 11,2 мкм

50 кала) в виде 1 капли, которая наносится на стерильное предметное стекло и покрывается стерильным покровным стеклышком.

Изучение образцов производят в световом микроскопе при х80 и х400. Целью исследования является нахождение тканевой паразитической формы грибов P variotii u

Р,ч!гЫ!з в виде эндоспор, молодой (промежуточная форма) и зрелой сферул. Эндоспора-круглок или яйцевидной формы образование, имеющее слабовыраженную светлую 2-х контурную оболочку и зеленый с флюоресцирующим оттенком центр размерами 0,4 — 1,0 х0,,4 х 1.5 мкм.

Молодая сферула (промежуточная форма) — почти круглое или овальное образование с 2-х контурной оболочкой зеленого цвета с флюоресцирующим оттенком и светло-зеленым центром, размерами 4,4 х 7,0 х

Зрелая сферула — округлое или овальное образование с истонченной 2-х контурной оболочкой, внутри которой определяются шаровидные образования— эндоспоры. Размеры зрелых сферул были

7,8 — 27,0 х 8,6 — 28 мкм.

В препарате также встречаются бесформенные образования — оболочки опустевших сферул. Обычно внутри их или на них обнаруживаются от одной до нескольких эндоспор, После осмотра стекла сохраняют на столе при комнатной температуре. Последующее их изучение осуществляется через 1,5 и

18 ч с целью выявления прорастания мицелия из вышеуказанных тканевых форм, Исследования на данном этапе позволяют дифференцировать пециломикоз от сепсиса или инфекции другой этиологии, что позволяет в течение первых же часов наблюдения больного приступить K этиопатогенетическому лечению.

2-й этап исследований.

Содержание 2-й пробирки после 18—

24-часовой инкубации в гепаринизированной среде 199 при комнатной температуре по 1,5 мл тонким слоем разливают по поверхности агаровых сред (1 — 3 чашки Петри) и далее сохраняют при комнатной температуре. Рост колоний обычно происходит на 4 день от момента посева.

Обследование проведено у 104 больных с клиническим диагнозом пециломикоз. в возрасте от 11 мес, до 67 лет, Как показали проведенные нами исследования с использованием вышеизложенного способа диагностики (табл.2), выделение грибов P.vaviotii и Р,viridls было достигнуто от 24 от 73 (в среднем 44 ), тогда как по имеющимся в

1775047

10

30

55 мировой литературе сведениям случаи выделения грибов рода Paecilomyces от больных не превышали 1 — 1,5 .

Пример 1. Б я Ш, 40 лет. После обработки кожи мякоти безымянного пальца спиртом сделан прокол кожи, после чего произведен забор крови в стерильный индивидуальный капилляр аппарата Панченкова и в равных частях внесли в 2 стерильные пробирки, содержащие по 5,0 мл стерильной гепаринизированной среды

199, Через 1,5 мин из осадка 1-й пробирки произведен забор 1-й капли крови, которую нанесли на стерильное предметное стекло и покрыли стерильным покровным стеклышком. При изучении капли в световом микроскопе в каждом поле зрения среди клеток крови обнаружены сферулы гриба, находящиеся на различных стадиях развития. Через 18 ч в капле на стекле, сохраняющейся при комнатной температуре, обнаружено прорастание сферул в мицелий.

Таким образом на 1-м этапе обследования больного в крови было обнаружено присутствие в ней сферул грибов рода

После суточной инкубации 2-й пробирки при комнатной температуре гепаринизированная среда с кровью была разлита по

1,5 мл по поверхности агаровой среды (сусло-агар) 3 чашек Петри и поставлены в термостат при температуре 25 С. На 4-й день инкубации в чашках Петри обнаружен рост от 1 до 4 колоний, которые были индентифицированы как гриб P.variotil.

Анамнестически установлено, что у больной в течении 6 лет после перенесенного гриппоподобного состояния (озноб, боль в носоглотке, головная и мышечная боли, слабость, недомогание, потливость) спустя неделю появилась одышка, усиливающаяся при физической нагрузке. периодическая заложенность носовых ходов и приступы удушья. Развитие последних наблюдалось при контактах с почвенной пылью и в ночное время. Заболевание протекало круглогодично с циклическими обострениями 1 — 2 раза в год в весеннее и (или) осеннее время.

Кроме вышеуказанных симптомов у нее периодически появлялись высыпания уртикарий, сопровождаемых зудом кожи, а также постоянно отмечались слабость, недомогание, потливость.

Клинически у больной установлена хроническая аллергическая интерстициальная пневмония, бронхиальная астма, ринит, крапивница.

В гемограмме больной: Нв — 160 г/л, эр. — 5,3 10 /л, Цп — 0,9,Л - ты 410 /л, и - 6, с

-35, э — 20, б — 1, л — 29, м — 9, СОЭ вЂ” 8 мм/ч.

Анализ мочи без изменений. С использованием радиоаллергосорбентного теста и иммуноферментного анализа в сыворотке крови больной обнаружены аллергенспецифические IgE — и lg G антитела к аллергену гриба Paecllomyces.

На обзорной рентгенограмме больной на фоне повышенной прозрачности легочной ткани с обеих сторон в средах и нижних отделах легких мелкосетчатая деформация легочного рисунка с наличием мелкоочаговых теней, располагающихся преимущественно по ходу сосудов. Корни легких расширены и деформированы, стенки бронхов уплотнены, B корнях увеличенные бронхопульмональные лимфатические узлы.

На; Синусовая брадикардия. Выраженные метаболические изменения в миокарде желудочков.

Функция внешнего дыхания; Изменение дыхательной функции по обструктивнорестриктивному типу.

Клинический диагноз: Инфекционно-аллергический бронхолегочный пециломикоз.

Хроническая рецидивирующая форма средне-тяжелого течения.

Использование предлагаемого способа выделения грибов рода Paecilomyces, позволило установить диагноз и провести этиопатогенетическое лечение с хорошим терапевтическим э рфектом.

П риме р2, Б-йу.,42лет, Образцы мокроты были взяты непосредственно в 2 чашки Петри со стерильной гепаринизированной средой 199. Через 15 мин из 1-й чашки был произведен забор материала, 1 капля которого была нанесена на предметное стекло, и покрыта стерильным tloKpoBHb!M стеклышком, При изучении капли мокроты в световом микроскопе обнаружено множество сфекул на разных стадиях развития (энедоспоры, молодые и зрелые сферулы). Через 1,5 ч в капле, сохранявшейся при комнатной температуре обнаружено прорастание мицелия из зрелых сферул, который наиболее был выражен через 18ч, После суточной инкубации мокроты в гепаринизированной среде 199 при комнатной температуре был осуществлен посев мокроты на агаровую среду Сабура в 3 чашках Петри. Чашки с посевами поставлены в термостат с температурой 25 С. На 4-й день с момента посева на 3-х чашках обнаружен рост от 1 до 8 колоний, которые были индентифицированы как колонии гриба Р virldis, Анамнестически установлено, что в течение 10 лет у больного. ранней весной

1775047 и/или осенью после гриппоподобного состояния кратковременное повышение температуры тела до 38 С спустя озноб, головные и мышечные боли, заложенность ходов с обычными водянистыми выделениями, 7 — 10 дней возникает одышка со свистящим дыханием, приступы удушья, периодическая заложенность носовых ходов, которые сочетаются со слабость1о, недомоганием, головокружением, повышенной потливостью. Данное состояние сохраняется в течение 1 — 1,5 мес, и исчезали. Установлена хроническая и аплергическая интерстициальная пневмония, бронхиальная астма, ринит, аллергический миокардит, анемия.

В гемограмме больного; Нв — 100 г/л, лейкоциты — 7;2.10 /л, и — 7, с — 48, э — 10, б — 3, л — 22, М вЂ” 10, СОЭ 30 мм/ч, Анализ мочи был без патологии.

С использованием радиоаллергосорбентного теста и иммуноферментного анализа в сыворотке больного обнаружены аллергенспецифические Ig E — и Ig G — антитела к грибу Paecilomyces.

На рентгенограмме больного с обеих сторон, больше справа, в нижне-легочном поле на фоне усиленного с пятнисто-сетчатой деформацией легочного рисунка наблюдались рассеянные мелкоочаговые тени с нечеткими контурами, Рисунок корней расширен, деформирован. В корнях увеличенные лимфатические. узлы.

На ЭКГ:синусовая аритмия, признаки нарушения внутрижелудочковой проводимости, диффузные изменения в миокарде желудоч ка.

Функция внешнего дыхания; нарушение дыхательной функции по обструктивному и рестриктивному типам.

Клинический диагноз: Инфекционно-аллергический бронхолегочный пециломикоз.

Хроническая рецидивирующая форма средне-тяжелого течения, Аллергический миокардит, Анемия, Клиническая картина заболевания, проявляющаяся первоначально в виде гриппоподобного состояния, спустя 7 — 10 дней от начала которого появляются клинические симптомы аллергии, наличие в сыворотке аллергенспецифических! д Š— и Ig 6 — антител к грибу Paecllomyces, а также культу10

20

25 инфекции и затем. спустя несколько дней, 45

50 ледуемый материал предварительно выдерживают в гепаринизированной среде

199 в течение 18 — 24 ч при 25 С, 30

35 ральное выделение из мокроты гриба P.

vIrIdIs позволили установить диагноз и провести этиопатогенетическое лечение с хорошим терапевтическим эффектом.

Положительный эффект предлагаемого метода выделения грибов рода

PaeciIomyces от больных заключается в том, что путем помещения патологического материала (кровь. грудное молоко, мокрота, моча, кал) в гепаринизированную среду 199 достигается сохранение жизнеспособности.сферул грибов P. varlotil u P.vlridis. Дальнейший перевод их среды обитания с температурного режима организма хозяина (37 С) на температурный режим комнаты (25 С) позволяет большинству из них начинать прорастание в мицелий в благоприятных условиях.

При сравнении результатов, получекных нами с использованием предлагаемого способа, с данными других авторов {табл,1) видно преимущество первого.

Он прост s исполнении. Позволяет в течение суток определять наличие грибковой дифференцировать ее.

Сравнительные данные выделения грибов рода РаесИогпусез от больных по известному и предлагаемому способам представлены в табл. 1.

Применение предлагаемого способа оказывает существенное влияние на выбор характера терапии и своевременность ее начала.

Способ показывает высокое совпадение с результатами клинического и иммунологического диагноза (табл.2).

Сводные данные выделения грибов рода

PaeciIomyces от больных с клиническим диагноэом пециломикоз представлены в табл, 2, Формула изобретения

Способ выделения грибов рода

PaecIiomyces из патологического материала больных путем его инкубации на агаровой среде при 25 С и микроскопического исследования для идентификации колоний грибов, отличающийся тем, что, с целью повышенил чувствительности способа, исс10

1775047

Таблица1

Таблица2

Составитель А.Ахунова

Редактор С.Кулакова Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Т,Палий

Заказ 3948 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101